聚合酶链反应解析.ppt

RT-PCR及定量RT-PCR （1）RT-PCR（reverse transcription-PCR） 原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。 是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。 PCR技术的主要类型 常用的两种逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus）： AMV来自禽成纤维病毒逆转录酶，最适温度为42℃。引物延伸反应通常用AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55 ℃, 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。 MMLV（Moloney murine leukemia virus）： M-MLV来自鼠白血病逆转录酶，M-MLV的最适温度为37℃，在更高温度下，M-MLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。  （2）定量RT-PCR（qRT-PCR）： 利用RT-PCR对mRNA水平进行半定量或绝对定量分析。 半定量RT-PCR 选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因mRNA作为内源性基因模板标准。 管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同进行逆转录，在各自的引物引导下扩增。 计算出扩增后目的基