第六章 酶分子修饰.pptVIP

目的：通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。 6.4 酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。 6.5 酶的分子修饰的其它要求 分子修饰剂的选择 选择性与一个氨基酸残基反应 反应在酶蛋白不变性的条件下进行 标记残基在肽链中稳定以易于分离鉴定 修饰反应程度能简单测定 反应条件的选择 不造成蛋白的不可逆变性 有利于专一性修饰 温度、pH、反应介质和缓冲液的选择 Chapter 6 Modification of Enzyme Molecule 第五章 酶的分子修饰 6.1 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 酶分子修饰的意义 提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 改变底物的专一性substrate specificity 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure 6.2 酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。 （1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。 酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例 6.3 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰, 大分子结合修饰(共价/非共价) 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰 (1) 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰 置换修饰的目的： 阐明金属离子对酶催化作用的影响 提高酶的催化效率 增强酶的稳定性 改变酶的动力学特征 金属离子置换修饰的过程 a. 酶的分离纯化 b. 除去原有的金属离子 c. 加入置换离子 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 (2) 酶的大分子修饰 采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶的催化特性的方法。 目的： 提高酶催化效率 增强稳定性 降低或消除酶蛋白的抗原性 大分子修饰(共价)的过程 修饰剂的选择 修饰剂的活化 修饰 分离 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。 酶 半衰期 相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)–SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)–SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35 h 350 (3) 酶分子的侧链基团修饰 采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法，称为侧链基团修饰。 作用： 研究酶的分子结构与功能 测定某一种基团的