酶的分离和纯化.pptVIP

第二章 酶的分离和纯化 Isolation and Purification of enzyme 方法概括 原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽 粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法 细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳 第一节 原料选择及预处理 动物原料：动物组织或脏器（活体取出） 充分脱血 -10℃ — -50℃保存 植物原料：植物原料 磨碎 加入缓冲液抽提 植物原料特点：1）纤维含量高 2）酚酶活力高 3）缓冲液pH易被细胞内物质改变 微生物原料：菌体培养 做酶活—时间曲线 确定最大酶活时间 细胞破碎 微生物细胞破碎一般采用 1）化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融 2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡 3）机械法：加磨料；研磨；挤压 4）缓冲液抽提 抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加5mM的Vc 第二节 酶的粗提 沉淀 核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉 （b）加入核酸酶将其降解 杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异 选择性沉淀（盐析）：最常用的方法 沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力 讨论： （a）盐的加入速度合适 （b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关 （c）硫铵浓度表示法；饱和度25℃4.