dna细胞周期检测.ppt

Key lab of Medical College of Su Zhou University DNA Analysis By Flow Cytometry 核医学生物技术重点实验室 基本原理概述 正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体； 进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。 通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。 流式DNA周期示意图 样本制备 来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析。新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。用组织切片的好处是可以通过观察常规染色来选择感兴趣的区域，缺点是不能再用抗体染色来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。 实体标本的单细胞制备 机械法：用剪刀、刀片剪切组织或金属网研磨获取完整的细胞。但该法获取的细胞数量少。 化学药品处理法：利用EDTA或Sodium citrate结合Ca2+或Mg2+等阳离子，破坏细胞间的连接或用Triton X-100、NP-40破坏细胞膜。该法只能取得细胞核，且易出现核凝集。 酶法：利用酶将细胞间的连接物水解，使细胞从组织中分离出。一般常用的为胃蛋白酶及胰蛋白酶。该法也只能取得细胞核。 细胞浓度及质量要求 单细胞和核的最终浓度应约106/ ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV和检测结果。 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片；大多数核有肿瘤样的外观(比如说，不是粒细胞)等。保证足够的肿瘤细胞含量；检测S%时建议的最小可接受比例是20%。 固定 常用70%的冰酒精固定单细胞悬液。应保证样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小时上。 对于甲醛固定的组织切片，应注意甲醛会影响PI与核酸的结合。若同时使用抗体鉴别肿瘤细胞，应选择对抗原无损的固定剂。对许多细胞 表面抗原来说，固定只能在抗体标记之后进行。 染色 染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于PI也与双链RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。在室温200C下避光孵育30分钟，3小时内上机分析。 影响荧光染色的因素 温度：温度高于200C时，即出现温度淬灭。 PH：PI在7.2~7.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。 荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。 固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。 杂质：溴化物、碘化物、硝基苯、铁、银等，对荧光有淬灭作用。 DNA的参考标准 样本的倍体是根据二倍体细胞峰的标准来计算的。临床标本中常常有一些正常的二倍体核存在，可用来作为标准。但问题是如何判断哪个峰是正常二倍体细胞。事先加入标准参照细胞(如鳖或鸡红细胞)会有助于判断。特殊细胞类型的特异性抗体标记也有助于检出肿瘤群体。标准参照细胞应尽可能早加入标本，与样本一起制备。 DNA检测 (1)DNA检测采用线性放大。应检查放大器的线性度(如用标准荧光微球、多倍体的肝细胞、有聚集体的固定的淋巴细胞、鸡和鲑鱼红细胞等)。 (2)应每日通过检测标准微球或固定、染色的淋巴细胞的CV来检查仪器调校情况，此CV应=2%。 (3)DNA直方图的道数值应至少为512。应以正常