細胞毒殺試驗SOP20120904-簡體版.doc

一、目的(Purpose)： 建立癌细胞毒杀活性分析的方法与流程 二、方法(Method)： 将血液以Ficoll进行离心分离后，将人类外围白血球(PBMC)与K562细胞共同培养，透过被破坏细胞所释放出的LDH(lactate dehydrogenase)，评估PBMC对于K562细胞的毒杀能力评估。 三、材料(Material) 1.实验所需仪器 1.1.无菌操作台(Laminar flow) 1.2.分光亮度计(Infinite M 200, TECAN) 1.3.37℃细胞培养箱 1.4.15 ml 离心管 1.5. 96孔U型细胞培养盘 1.6. Ficoll-Paque premium 1.7. 96孔Immunoplate 1.8. 悬臂式离心机 1.9. 75T细胞培养皿及25 T细胞培养皿 1.10. 3 ml无菌抛弃式塑料滴管 1.11. 20~200 (l微量分注器及10~1000 (l微量分注器 1.12. 已灭菌200 (l tip及已灭菌1000 (l tip 1.13. 95%酒精及酒精灯 1.14. 1.5 ml eppendorf及棕色eppendrof 1.15. 50孔15 ml离心管架 1.16. 细胞计数器 1.17. 0.22 (m过滤杯 1.18. 水浴槽 2.实验所需试剂 2.1. CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega Cat. No.G1780) 2.2. RPMI-1640 medium(Gibco Cat.No22400-071) 2.3.FBS(胎牛血清) (Gibco Cat. No.10091-148) 2.4. PSN (Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture, Gibco Cat. No. 15640-055) 2.5.10× PBS buffer或1× PBS buffer 2.6. Trypan Blue Solution (Fluka Cat. No. 93595?,0.4% ?for microscopy) 3.试剂配制 3.1.配制1× PBS buffer 3.1.1.在1000 ml量筒量取100 ml 10× PBS buffer，再加入RO水至量筒刻度1000 ml的位置。 3.1.2.混合均匀后，倒入1L 的血清瓶中，旋上盖子后微旋松，贴上灭菌带，进行121℃、20分钟高压灭菌。 3.1.3.灭菌完成后取出，将盖子旋紧，置于室温备用。 3.1.4.进行实验操作时取用需于无菌操作台内操作。 3.2.配制1L 的70%酒精 3.2.1. 一般实验室可购买为95%酒精： 95%×V1=70%×10 ∴V1=7.37L(公升) 3.2.2.依据上述估算结果，量取95%酒精7.37L(即7370ml的酒精)； 3.2.3.加入2.63L(10－7.37=2.63)的R.O.水，混合均匀即可。 3.3. LDH Substrate Mix试剂配制方法(不需于无菌操作台内操作) 3.3.1.将-20℃的CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit中的LDH assay buffer置于室温中回温溶解。 3.3.2.将LDH assay buffer平均分装于5管15 ml离心管，每管12 ml。 3.3.3.用铝箔纸包裹15 ml离心管避光，置于-20℃保存备用。 3.3.4.配制时，从-20℃取出分装好的 LDH assay buffer(12ml)置于室温中回溶。 3.3.5.待LDH assay buffer完全变成液体后，将buffer加入从-20℃拿出来的substrate mix powder中(盖子可能沾有粉末，因此开盖时请小心)。 3.3.6.混合均匀后，分装到1.5 ml eppendorf中(建议以棕色eppendrof分装)，放回-20℃保存使用，过程中请避光操作。 3.4.配制含10% FBS之RPMI-1640 medium (需要在无菌操作台中进行，确保无菌状态) 3.4.1.将FBS从-20℃冰箱中取出，于室温或是37℃水浴解冻后，以56℃、30分钟水浴去补体，再分装到50 ml离心管中。为避免爆管污染的情形发生，每管约分装45 ml的FBS，以parafilm封好管口，再放到-20℃中冰冻保存备用。 3.4.2.将100× L-glutamine从-20℃冰箱中取出，在37℃水浴中解冻并至底部白色粉末完全溶解，再