HPLC 一般性故障排除.pptVIP

一般性故障排除 要保留记录 HPLC 色谱柱的测试 对新拿到的色谱柱进行等度洗脱的记录: 记录理论塔板数, N, 同时有: 色谱柱的长度和直径 化合物的和 k‘ 值 流动相和固定相 流动相流速 样品量 温度 峰对称性. 包括, 酚和胺} 为测试抗酸、碱性. 记录: 柱压 完成分析 维修数据 关心照顾HPLC 避免出现故障 保留时间和峰面积的重复性 可能造成保留时间的故障: 流动相组成变化 溶剂输送系统故障 色谱柱平衡问题 色谱柱故障 色谱柱箱温度 可能造成峰面积问题的原因: 进样器故障 泵流路故障 检测器平衡故障 一般泵故障 夹带空气 流动相脱气 使泵初始化 阀 密封件 活塞 泄漏 手动进样阀 色谱柱故障 不合适的注射体积或型号 阀堵塞 进样口泄漏 样品携留 交叉口泄漏 自动进样器 一般性检测器故障 检测器性能 检测器时间常数- 太高 检测器时间常数- 太低 排除压力故障 基线波动 故障来自检测器还是泵? 你怎样说明? 混合故障 故障: 一种UV-吸收的流动相和非UV吸收的流动相动态混合。 有UV-吸收的残余流动相。 泵噪音引起。 解决办法: 增加一个混合器. 缺点是死体积增加。 检测器 - 热交换器 保证流通池恒温提高检测器性能。 基线噪音 可能的原因: 流通池脏 检测器灯坏 泵出现周期性的脉冲 检测器的温度影响 空气泡进入检测器 回答问题: 你改变了流动相成分吗? 你改变了波长吗? 你的仪器最后一次使用什么流动相? 你有混溶性的问题吗? 你的溶剂脏了吗? 色谱柱维修/再生 - 物理性堵塞 装上色谱柱/不装色谱柱时检查柱压降 如果柱两端反压高，把色谱柱倒过来用流动相冲洗10-20个柱体积，再测试反压 如果有沉淀, (即聚集的蛋白质，细胞物质，聚合物）用适当可溶解的溶剂清洗堵塞物，如0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M胍， HCl, THF, HFIP 如果不成功，更换塞子 进样口塞子 更换柱塞子 色谱柱维修/再生 - 用化学方法改变色谱柱 由于键合相的水解或硅胶溶解使柱填料的改变是不可逆的 由于污染而造成柱填料的改变一般是可逆的，可用适当的溶剂冲洗掉 梯度洗脱方式（水 - 强溶剂）常常十分有效 低pH流动相，如. 0.1% TFA 或 0.01M H3PO4，很有效 提高温度也有帮助 (60-80℃). 基线漂移 梯度洗脱 温度不稳定 (示差折光检测器) 流动相污染 流动相在柱中没有平衡 系统有污染物流失 鬼峰 峰形- 双峰 柱中有死体积 塞子部分被堵 只有一个双峰- 共流出化合物 峰形- 加宽峰 所有的峰加宽 柱效降低 柱死体积 进样量大 流动相粘度高. 某些峰加宽 前一个样品的洗脱峰 分子量大 样品 - 蛋白质或聚合物 柱外体积 在进样器和色谱柱以及色谱柱和检测器之间使用短而内径细的管子 所有的管件一定要使用匹配的接头 使用小体积的检测池 进样体积要小 峰形- 拖尾 原因: 一些峰拖尾 次要的 - 保留效应 残留硅醇基作用 在大峰上有小峰洗脱出来 所有的峰拖尾 超柱效应 在柱进口处污染物增加 重金属 色谱柱不好 色谱峰形- 前伸峰 原因: 柱过载 小峰在大峰前洗脱出来 色谱峰形-负峰 原因: 样品的吸光度小于流动相 当样品溶剂通过色谱柱时平衡的扰动 对示差折光检测器来说是正常的 于保生 记录: 完成分析的维修数据 标准色谱图 运行记录本 Date Logbook Service 11/2/94 12/1/94 12/4/94 check valves pump seals new column pH范围 仪器 pH 范围 2.3 - 9.5 扩展 pH范围 2.3 - 12.5 腐蚀不锈钢 盐酸 无机酸和强酸 碱金属卤化物 (氯化纳, 碘化锂) 四氯化碳和2-异丙醇或THF 络合剂 (EDTA, 柠檬酸, 乙酸) 侵蚀石英和vespel 碱性溶液, pH11 使用上述物质时HPLC要经常性维护，如果使用，HPLC的泵和其他部件在完成实验后要彻底冲洗. 峰保留时间精密度: ??有柱箱: 0.3% ??无柱箱: 0.7% 峰面积精密度: 1.5% 手动进样阀- 六通固定进样环 到废液池 进样环 (定体积) 来自泵 到色谱柱 样品注射器 加样 进样 到色谱柱 故障: 有关样品 在未预先充样时针和管道被堵塞 当样品瓶中有密度梯度时，峰高重复性差 针 由于隔垫造成的堵针 针弯曲 排除: 需要时更换针座 需要时更换针 需要时更换自动进样器中的转子或密封圈 样品 试剂 试剂 进样单元 计量装置 来自泵 到色谱柱 6-位阀 到废液瓶 沾污的流通池 老灯 时间 mAU 用于参考的基线噪音测定 以mAU或RI单位记录基线宽度，用于以后的比较. 数据速度 20 Hz 响应时间