五重PCR检测转基因大豆.docVIP

五重PCR检测转基因大豆 张秀丰苏旭东张伟袁耀武周巍张会彦齐哲 (河北农业大学食品科技学院，保定071001) 摘要旨在建立一套准确、快速、可靠的用于转基因大豆检浏及DNA提取方法;以35S启动子 ( Cauliflowennosaicvitus 35S , CaMV 35S) , N.终止子(Nopalinesynthase, Nos) , NPT } , CP4一EPSPS四种外源基因和 大豆内源基因(Lectin)为检测的目的片段，建立五重PCR反应体系，并采用改进的方法提取DNA，进行PCR扩 增，实际检浏了已知转基因大豆和市售大豆;改进的DNA提取方法与经典的CTAB方法相比，提取时间至少缩 短了1h，降低了提取成本。经过PCR扩增对五种外源基因进行了检测，经DNA浏序证实了产物为目的扩增 产物。转基因大豆的检出限为0.2% } 0.5%。改进后的DNA提取方法能够快速提取用于PCR扩增的高质量 模板，消除了PCR反应的抑制因子;建立的五重PCR反应体系能够高效、准确的检测转基因大豆。 关健词转基因大豆DNA提取多重PCR检测 随着转基因产品商品化，使得转基因植物、动 物、微生物加工而成的转基因食品在传统食品市场 中的份额在不断加大，转基因食品已经在人们不知 不觉的日常生活中走进了人们的餐桌，进人了食物 链。然而，转基因食品中含有新的遗传物质，即外源 DNA以及由外源基因编码的新蛋白，而传统食品是 不存在这些情况的，并且传统食品是经过人类几千 年的食用证明是安全的，因此转基因食品的安全性 是摆在人类面前的重大难题;由于转基因食品的安 全性在较短的时间内无法确定，因此，目前各国对转 基因食品都采用标签制度进行管理，所以急需建立 一套能够对转基因食品进行准确、快速检测的方法。 在转基因食品检测方面主要从蛋白和核酸两方面人 手。基于蛋白检测的方法主要是ELISA酶联免疫) 法[’〕，该方法主要应用于无须加工的原料性食品，而 且抗体和抗原的制备较为困难，价格昂贵。基于核 酸检测的主要是DNA杂交和PCR法[fzJ等，但是国内 外在转基因食品检测方面主要采用普通PCR、多重 }[ 3〕和实时PCR技术[[4J。 Iaurent Tlnon0等[[5J曾利用 普通PCR技术进行转基因食品检测;C . Tengel等[’] 利用PCR技术检测转基因大豆和转基因玉米;多重 PCR在医学上应用较多，但在转基因食品检测方面 还比较少。由于实时PCR设备昂贵，检测费用高，所 以大多利用普通PCR和多重PCR技术，且多重PCR 大多为三重PCR技术，通量较低，容易漏检。因此本 研究采用以CaMV35S,NOS,NPTII ,CP4一EPSPS四种 外源基因和用于内标的I,ectin大豆凝集素)基因建 立五重PCR检测技术，通量较高，提高了检测效率， 避免了漏检。在大豆DNA提取方面方法较多，主要 有试剂盒、碱裂解法、蛋白酶K法等，有的试剂和设 备昂贵，有的程序繁琐，有的提取的模板纯度低、质 量较差，不利于PCR的扩增，因此本试验对CfAB[}l 的提取方法进行了改进。本研究拟探索高效、低成 本的大豆DNA提取技术，建立快速、准确、高效的五 重PCR检测转基因大豆的方法。 基金项目:河北农业大学科技发展基金(zoos一m 收稿日期:zom-o3-zs 作者简介:张秀丰，男，i9si年出生，硕士，食品安全 通讯作者:张伟.男，1963年出生，教授.食品安全 1材料与方法 1.1材料 1.1.1转基因大豆及质粒来源 CP4 - EPSPS转基因大豆:中国农业科学院粮油 作物所赠，质粒pBI121由本实验室保存。 1.1.2主要溶液 CTAB裂解液、抽提液、CTAB提取液、TE缓冲液。 1.1.3仪器及试剂 10 x PCR buffer, dNTPs, TaKaRa Taq, DNA Marker DL2000:大连宝生物工程公司;引物(正向引物，反向 引物)由大连宝生物工程公司合成;无水乙醇、氛仿、