何水林版基因工程第四章 基因操作过程(教学版).pptVIP

第四章　基因操作过程　 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 特 异 性：基因组扩增、RT-PCR 保 真 性：基因筛选、测序、 TA克隆 长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学 扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测 Ⅱ简并引物设计（degenerate primers) 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 同源性比较 /blast/blast.cgi 中在线比较 采用OMIGA，PGCENE进行两两比较或多序列比较 3.2　PCR技术基本原理和操作 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 基本反应步骤 变性 退火 延伸 变性 3.2.1　PCR技术基本原理 ①　模板DNA的变性 　　模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 ②　模板DNA与引 物的退火(复性) 　　模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③　引物的延伸 　　DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5min 模板DNA dNTP 引物 Buffer Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 94℃ 30s 55 ℃1min 72 ℃2.5min Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 72 ℃ 7～10 min 第二轮扩增 第三轮扩增 第一轮扩增产物 目的基因 目的基因 琼脂糖凝胶电泳 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用下面的公式计算。 PCR反应动力学 Y＝(1＋X)n Y：代表DNA片段扩增后的拷贝数 X：表示平均每次的扩增效率 n：代表循环次数 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值 每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应 3.2.2　PCR技术反应体系、条件和过程 引物、酶(热稳定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液 ①　PCR反应的基本成分 　　　10×扩增缓冲液 　 　10ul　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 　各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　 Taq DNA聚合酶 　 　2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 　1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　 　100ul 标准的PCR反应体系： ddH2O 11μL cDNA第一链模板 1μL 2×GC buffer 25μL dNTP (25mmol/L) 8μL P7(10μmol/L) 2μL P8(10μmol/L) 2μL LA Taq DNA polymease 1μL 在0.1mL离心管中加入下列溶液: 总体积 50μL RT-PCR ②　10×扩增缓冲液 KCl 500mmol.L-1 Tris-HCl 100mmol.L-1(pH8.3-8.8) MgCl 15mmol.L-1 明胶　　　 0.1% 在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2，二价阳离