转基因生物反应器.docVIP

编号 2010211746 细胞工程论文 题 目： 转基因螺旋藻的光生物反应器培养及鉴定 学 院： 农业与生物技术学院 业： 生物 王娟丽 指导教师： 张慧瑛 职称： 讲师 完成日期： 2013 年 6 月 6 日转基因螺旋藻的光生物反应器培养及鉴定 摘要:以本实验室构建的转胸腺素基因螺旋藻为藻种，利用中科院过程工程研究所研制的PhR-L20C光生物反应器，根据该反应器的各项性能指标和参数条件，采用本实验室优化过的培养条件，对转化藻进行高密度培养，初始pH值约为9.0，光照强度平均约为10 000 Lx，培养温度28-30℃，一个培养收获周期为10 d，平均生长速率为0.3 OD560·d-1，10 d后藻细胞OD560达3.0，最终藻细胞密度可达到1.3 g·L-1(干重);高密度培养后的转化藻经PCR鉴定，目的基因能够稳定地整合在螺旋藻染色体上，经Western2blot证明外源基因在螺旋藻中获得高效表达，且在光生物反应器中经过30 d的无抗生素G418的高密度培养后，外源基因能够稳定的遗传表达。 关键词:螺旋藻；转基因；光生物反应器；高密度培养 引言 螺旋藻是一种呈螺旋状、不分枝的丝状微藻，因其形似螺旋而定名为螺旋藻，是地球上最早的光合生物之一。螺旋藻在分类上属于蓝藻门(Cya2nophyta )蓝藻纲(Cyanophyceae)段殖藻目(Homogonals )颤藻科(Oscillatoriaceae)。其营养丰富，蛋白质含量可占干重的60%-70%，细胞内富含氨基酸、维生素、β胡萝卜素、微量元素、小分子多糖、糖蛋白、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质，且营养成分含量十分均衡、合理，因此螺旋藻长期被作为功能性保健食品和饲料添加剂使用。另外由于螺旋藻细胞具有使蛋白质高效表达的机制，且能容受高浓度的单一蛋白，对外源蛋白容受力高，培养条件简单，繁殖快，成本低等优点，使其成为极具开发潜力的生物反应器。本验室利用基因工程技术已构建获得转胸腺素基因螺旋藻，并进行了鳗鱼苗喂饲试验，证明可提高鳗鱼苗的免疫力，可作为水产动物的免疫增强功能的饲料添加剂使用，可以有效提高鱼类的抵抗力和存活力。目前该转基因螺旋藻已经获得农业部颁发的农业转基因生物安全证书[农基安证字(2006)第044号]。该证书是我国第一个螺旋藻的转基因安全证书，允许进行该转基因工程藻的生产应用。本研究是以此转胸腺素基因螺旋藻和野生的螺旋藻为藻种，采用中国科学院过程工程研究所研制的PhR-L20C型光生物反应器作为种子罐进行高密度的培养优化研究，并进行稳定性检测鉴定，为大规模工业化生产提供了一定科学依据。 1　材料和方法 1．1　主要仪器 DZ-900回转振荡器:中国太仓市实验设备厂； Virsonic 475超声细胞破碎仪:美国VirTis公司；PowerPac300电泳仪:美国Biorad公司；T1Thermocycler型PCR仪: Biometra公司。PhR-L20C型光生物反应器及相关参数:中国科学院过程工程研究所研制，反应器由罐体、气体提升管、内光源密封管、热交换装置、气体分布器、内外光源等部分组成。罐体、气体提升管和内光源密封管由耐热玻璃制作，可进行蒸汽消毒。以日光灯作为内外光源。罐体高100 cm，直径16cm，总体积20 L，有效体积16-18 L。底部设有不锈钢烧结板制成的圆形气体分布器，空气和CO2定量混合后通入反应器，并配置溶氧、pH、温度等在线检测系统。几何参数如下:高径比(H/D)6.25 ，提升管截面积Ar与下降截面积Ad比值为1.1 ，气体分布器直径5cm，分布器孔径80μm ，光照面积与体积的比值大于50 m-1。 1.2　试验材料 1.2.1　藻种　 钝顶螺旋藻(野生藻株)由本实验室保存，转胸腺素基因螺旋藻(转化藻株)由本实验室构建。 1.2.2　培养基　 采用常规的Zarrouk培养基。 1.2.3　螺旋藻染色体提取液　 溶液A：Tris-HCl (pH8·0) 50 mmol·L-1， EDTA 5 mmolL-1，NaCl 50 mmol·L-1；溶液B： Tris-HCl50 mmol·L-1，EDTA 50 mmol·L-1， pH8·0;溶液C： Tris 30 mmol·L-1， EDTA 10 mmol·L-1， sarkosyl 2%。 1.3　试验方法 1.3.1　转胸腺素α1基因螺旋藻接种物的一级培养 取1L容量的三角瓶2-3个，按3%的接种量接