差速贴壁法原代培养椎间盘髓核细胞中的应用优势.doc

差速贴壁法原代培养椎间盘髓核细胞中的应用优势 胡永凯，孙浩林，漆龙涛，李淳德(北京大学第一医院骨科，北京市 100034) 引用本文：胡永凯，孙浩林，漆龙涛，李淳德. 差速贴壁法原代培养椎间盘髓核细胞中的应用优势[J].中国组织工程研究，2016，20(42):6284-6289. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.008 ORCID: 0000-0002-7368-1412(胡永凯) 文章快速阅读： 文题释义： 差速贴壁法：根据不同类型细胞黏附于某固相物质表面生长的能力的差异，即某些细胞黏附能力强或作用快而另一些细胞黏附能力弱或作用慢，接种后收集或去除未贴壁细胞，从而将某特定类型细胞进行分离以达到逐步纯化的目的。 原代培养：是指直接从机体取下组织、器官和细胞后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。但通常把第1代至第10代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。 摘要 背景：髓核细胞作为椎间盘的主要功能细胞是退变机制研究的重点对象，维持体外培养的髓核细胞的生理功能及细胞表型的稳定至关重要。 目的：通过对照研究差速贴壁法在大鼠椎间盘髓核细胞原代培养中的应用优势。 方法：取4周龄雄性Wistar大鼠20只，体外分离培养椎间盘髓核细胞，待原代细胞汇合近90%时进行分组传代，差速贴壁组在传代细胞贴壁30 min时，将未贴壁细胞吸出重新调整浓度后传至新的培养皿中，对照组不作处理。差速贴壁组第1、2代细胞均采用该法分离纯化。对两组第3代细胞进行细胞形态学比较及免疫组化鉴定纯度分析、CCK-8检测细胞功能活性并绘制细胞生长曲线。 结果与结论：①倒置显微镜观察及苏木精-伊红染色，差速贴壁组细胞均一性较对照组明显增高，对照组髓核细胞中混有较多的成纤维样细胞；②Ⅱ型胶原免疫组化鉴定及纯度分析，2组细胞胞浆均为被染成黄褐色，证实为髓核类软骨细胞；③纯度分析差速贴壁组阳性率显著高于对照组(P 0.05)；④CCK-8细胞生长曲线显示，2组细胞均经过2 d的生长潜伏期，3 d的指数生长期，进入生长停滞期，而对照组较差速贴壁组在潜伏期和指数增长期的早期生长更迅速。⑤结果说明，差速贴壁法是原代培养大鼠髓核细胞一种实用、有效的分离纯化方法；原代培养、经2次差速贴壁法分离纯化的第3代大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致，细胞纯度更高，其对数增长期可以作为椎间盘细胞机制研究的最佳时期。 关键词： 组织构建；软骨组织工程；差速贴壁；髓核细胞；纯化；细胞去分化；细胞老化；国家自然科学基金 主题词： 椎间盘；细胞，培养的；细胞衰老；组织工程 基金资助： 国家自然科学基金 Excellence of differential velocity adherent procedure in primary culture of nucleus pulposus cells of intervertebral disc Hu Yong-kai, Sun Hao-lin, Qi Long-tao, Li Chun-de (Department of Orthopaedics, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China) Abstract BACKGROUND: As the main function cell of intervertebral disc, nucleus pulposus cells are the focus of studying the degenerative mechanism; thereby, it is crucial to maintaining the physiological function of nucleus pulposus cells in vitro and the stability of the cell phenotype. OBJECTIVE: To study the excellence of differential velocity adherent procedure in primary culture of nucleus pulposus cells of rat intervertebral disc through comparison. METHODS: Twenty male Wistar rats aged 4 weeks were enrolled, and then nucleus pulposus