Northernblot实验步骤..docVIP

一、这一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H+梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含有乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。 1、在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体： 6mol/L乙二醛 5.4ul DMSO 16.0ul 0.1mol/L磷酸（pH7.0） 3.0ul RNA（多达10ul）5.4ul市售乙二醛通常为40%溶液（6mol/L）。由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10ug RNA，通常用10－20 ug 细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5－3.0ug poly（A）+RNA。 2、将微量离心管盖严，将RNA溶液置于50温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。 3、于50温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 %琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品， 而用1%琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。加入0.1mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，升温至70 ， 加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%H2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。 4、将RNA样品冷却至0，加入4ul 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛-DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或9S兔－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。 乙二醛-DMSO凝胶加样缓冲液 50%甘油 10mmol/L磷酸钠（pH7.0） 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 5、将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以3-4V/cm电压降进行电泳，同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度 内（pH8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）。另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。 6、电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5ug/ml， 用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。 7、RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。 二、将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜 电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983）。 但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。如果琼脂糖中浓度大于1%或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。 1、将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位