实验3 蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法.ppt

实验三 蔗糖酶蛋白含量的测定 ——Folin-酚法 * * 一、实验目的和要求 1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； 3、掌握分光光度计的使用方法。 二、实验基本原理 Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点： 该反应受多种因素的干扰。 1. 蛋白质(肽键) OHˉ 甲试剂 (酒石酸钾钠铜盐) 生成紫红色络合物 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸 紫红色络合物 OHˉ 乙试剂 产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物） 二、实验材料与试剂 1、实验材料： 蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。 2、实验试剂： ⑴ 标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 ⑵ Folin-酚试剂 ① 甲试剂 ② 乙试剂 三、实验器材与仪器 1、试管及试管架； 2、可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿； 3、恒温水浴箱(25℃）。 四、实验操作方法和步骤 1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线 取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（ A500nm值）。 混匀，在室温下静置20min 混匀，在室温(25℃）下静置10 min 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin-酚试剂乙 （ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水 （ml） 5 5 5 5 5 5 Folin-酚试剂甲 （ml） A500nm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5g/L标准蛋白质溶液（ml） 6 5 4 3 2 1 试管号 表1 2、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定 由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。 取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（ A500nm值）。 0 A500nm 混匀后，室温（25 ℃ ）放置20分钟 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin－酚乙试剂(ml) 混匀后，室温（25 ℃ ）放置10分钟 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Folin－酚甲试剂(ml) 0.5 0.8 0.95 0.5 0.8 0.95 0.5 0.8 0.95 0.5 0.8 0.95 1.0 水(ml) 0.5 0.2 0.05 0.5 0.2 0.05 0.5 0.2 0.05 0.5 0.2 0.05 0.0 样品液V(ml) 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 编 号 Ⅳ(原液) Ⅲ(1:4稀释) Ⅱ(1:4稀释) I(1:4稀释) 空白 样 品 表2