实验二 PCR扩增及其产物的纯化.pptVIP

实验二 　PCR扩增实验三　PCR产物的纯化 实验目的和要求 学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法; 学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术. 实验原理 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR ) 原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。 每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 材料与试剂 PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。 作业 分析并讨论PCR扩增结果与纯化后结果 * PCR 反应系统的组成引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。 实验步骤 PCR反应体系（每人３小管） 模板DNA 0.5 ul (10ng) 引物1 0.2ul (10uM) 引物2 0.2 ul (10uM) dNTPs 1 ul (1mM) Taq DNA聚合酶 0.2 ul(5U/ul) 10×缓冲液(Mg2+) 3 ul 去离子水 25 ul 总反应体系 30ul 94℃变性5min后，开始以下循环：94℃变性反应40s55℃退火反应30s72℃延伸反应1min最后72℃反应2min 3２个循环 PCR反应条件 PCR产物电泳检测 PCR产物分析取5ul PCR产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。 学生PCR实验结果 A.从PCR产物中直接回收纯化DNA (Promega 公司) 直接加100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μl PCR反应物； 进入C步骤。 回收PCR产物常采用两种方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。 DNA回收纯化 B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA 用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带； 用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带； 将300μl (300mg) 琼脂糖条带转移至1.5ml离心管。直接在65℃温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）； 加等体积的溶液BE； 下接C步骤。 C.纯化步骤 将PCR产物转移至一个1.5ml的离心管，向其中加入等体积溶液BD，混合均匀。 将步骤1所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。 12000rpm离心1min，弃滤液。此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上 加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。洗脱硅胶上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获取高质量的DNA片段 加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。 12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中的液体。去除残留乙醇，避免乙醇影响后续酶促反应，同时也有利于DNA的充分溶解 将离心柱置于新的1.5ml离心管。向纯化柱的中央处，悬空滴加15μl溶Ｅluent(60℃预热)，静置２min．12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段。贮存于-20℃备用。 学生PCR实验结果(4?l) PCR 产物纯化后(相当于0.8 ?l原PCR产物） PCR 纯化并酶切后 (2?l) 3kb=62.5ng 1kb=21.0ng *