动物细胞融合概念.ppt

动物细胞融合 实验人：韦兴祥 李济安 赵莉 一、实验原理： 病毒诱导融合： 病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病 毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病 毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内 酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。 优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中 大量繁殖，容易培养； 缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过 程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。 聚乙二醇PEG诱导融合: 在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发 生细胞凝集作用；聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前 还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便， 诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有 些细胞(如卵细胞)不适用。 电融合： 20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混 合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加 高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，当受到电 击时，细胞部分区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细 胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许 多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操 作简便，可重复性好。 二、实验器材与试剂 器具: 显微镜 离心机 天平 离心管 细滴管 载片、盖片 酒精灯 试管 2 试剂: 50%聚乙二醇(PEG)：称取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度试管中在 酒精灯火或沸水中加热溶化。待冷至50℃时，加入等体积并预热至 50℃的GKN液混匀。 Alsver液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。 GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml重蒸水中。 0.85%NaCl液 三、实验内容及方法 1.用注射器取2ml Alsver液，再从翼下静脉取鸡血2ml，注入 管内，再加6ml Alsver液，混匀后置4℃冰箱中可备作3-4用。 2. 实验时取“1”液1ml于离心管中，加入4ml 0.85%的NaCl 液，混匀平衡后以1200rpm离心5min。 3. 去上清液。再重复“2”两次，最后一次离心10min。 4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混匀使之成为细胞悬液。 5. 在“4”液中加入6—8滴（约0.5ml）50%的PEG液，迅速混匀，常温下2-3min滴片镜检。 四、结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡血细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡血细胞。 五、融合率的计算 在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数 (包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。 * * 细胞融合（cell fusion）又称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。 在诱导物:如灭活的仙台病毒(sardai virus)、聚乙二醇(PEG) 作用下，相互融合的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，形成双核或多核细胞。PEG是一种去垢剂，易得，用法简单、融合效果稳定，是目前运用比较多的诱导剂。