2基因工程工具酶概述.ppt

2 基因工程工具酶 2.1 限制性核酸内切酶 2.2 连接酶 2.3 DNA聚合酶 2.4 末端转移酶 2.5 核酸酶 2.6 核酸外切酶 2.7 T4噬菌体多核苷酸激酶 2.8 碱性磷酸酶 2.1 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶的命名 II 型限制性核酸内切酶的基本特性 切割方式A 切割方式B 切割方式C 同裂酶 同尾酶 酶的活性及影响因素 限制性内切酶切DNA的方法 单酶切 双酶切 部分酶切 2.2 连接酶 T4 噬菌体DNA 连接酶 T4噬菌体基因30编码的产物。 需要ATP作为辅助因子。 用途： 连接两个带有互补黏性末端的双链DNA分子； 连接两个带有平头末端的双链DNA分子； RNA：DNA杂合体中DNA链上的切口。 大肠杆菌DNA连接酶 lig基因编码的产物。 需要NAD+作为辅助因子。 用途： 连接两个带有互补黏性末端的双链DNA分子； 一条链带切口的双链DNA分子。 Tsc DNA 连接酶 源自温泉菌 短时间高温处理仍有活性 用途： 催化单链DNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。 影响连接反应的因素 DNA末端的浓度 反应温度与反应时间 ATP浓度 2.3 DNA聚合酶 DNA pol I Klenow 片段 补平3’凹陷末端。 对带3’凹陷末端的DNA分子进行末端标记。 合成cDNA的第二链。 利用Sanger双脱氧末端终止法的DNA测序。 在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体外突变。 T4噬菌体 DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，由噬菌体基因43编码 。 比Klenow酶的外切酶活性高100-1000倍。 外切酶活性对单链的作用比双链高。 T4噬菌体DNA聚合酶的置换合成标记法 T7 DNA聚合酶 来源于T7感染的大肠杆菌，T7噬菌体基因5编码的蛋白质和大肠杆菌的硫氧还蛋白的复合物。 持续合成能力最强。 合成DNA片段可达1000bp以上。 测序酶：改造的T7 DNA 聚合酶，去除了外切酶活性，保留了聚合酶活性。 其他DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 高耐热性。 5????聚合酶活性和???5?外切酶活性。 需要Mg2+作为辅助因子。? 逆转录酶 来自反转录病毒。 以RNA为模板。 具有5????聚合酶活性和RNA酶H活性。 2.4 末端转移酶（TdT） 来源于小牛胸腺。 将脱氧核苷酸聚合到DNA分子的3’-OH末端。 需要二价阳离子（Mg2+）。 不需要模板。 对突出的3’-OH末端效率高。 对平端和3’-OH凹陷末端的双链DNA和单链DNA，需Co2+激活，效率低。 末端转移酶的用途（1） 添加同聚体尾巴，将载体和目标DNA连接起来，可用于文库构建,5’-RACE。 末端转移酶的用途（2） DNA的3’-OH末端标记。 2.5 核酸酶 降解核酸的水解酶，分为三类：核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、核酸酶。 常用的核酸酶： （1）核糖核酸酶： 核糖核酸酶A 核糖核酸酶T1 核糖核酸酶H （2）脱氧核糖核酸酶I （3）S1核酸酶 核糖核酸酶---核糖核酸酶A 核糖核酸酶A（RNase A）：内切核糖核酸酶，来源于牛胰脏。 切割机制：攻击RNA上嘧啶碱基的3’端。 反应条件极宽，极难失活。 低盐浓度（0-100mM）: 切割单链和双链RNA； 切割DNA:RNA杂交体中的RNA。 高盐浓度（≧300mM）: 特异切割单链RNA。 可被胎盘RNA酶抑制剂（RNasin）或氧钒-核糖核苷复合物（VRC）抑制。 用途： 从DNA：RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。 确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。 RNA检测----核糖核酸酶保护分析法。 降解DNA制备物中的RNA分子。 核糖核酸酶---核糖核酸酶T1 核糖核酸酶T1（RNase T1）：内切核糖核酸酶，来源于米曲霉。 切割机制：攻击RNA上鸟嘌呤核苷酸3’端磷酸。 反应条件极宽，极难失活。 类似于核糖核酸酶A。 核糖核酸酶---核糖核酸酶H 核糖核酸酶H（RNase H）：来源于小牛胸腺组织。 特异降解DNA:RNA杂交双链中的RNA链。 用途： 与DNA聚合酶I和DNA连接酶共同参与cDNA第二条链的合成。 脱氧核糖核酸酶I 脱氧核糖核酸酶I