3研究方法和手段课件.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法和手段 一、显微镜技术 二、细胞的分离及培养 三、细胞组分的分离分离 四、细胞内分子的示踪 五、基本的分子生物学实验技术 第一节 显微镜技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ 几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 原理 用途：观察未经染色的玻片标本 偏光显微镜polarizing microscope 倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 电子显微镜 (Electron microscope) 1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。 电子显微镜概述 ?电子显微镜的基本结构 电子显微镜基本结构由三大部分组成: ●电子光学系统由照明系统、标本室、 成像系统、观察窗和记录用的照相机等 组成； ●真空系统是保持电镜的真空度； ●电子学系统即供电系统，需要高压稳压。 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 不同光线的波长 扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 电子染色 标本对电子的散射能力取决于其组成 元素的原子序数,原子序数越高,散射的电 子越多,反差就越大。生物分子是由一些原 子序数很低的轻元素(氢、氧、碳、氮等) 组成的,它们散射电子的能力很弱,在电镜 下几乎不存在明暗反差。为使生物样品加 大反差,就要进行染色,即用重金属增加电 子散射能力,称为电子染色。 制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和