04章核苷酸和核酸4.jsp课件.ppt

Pyrosequencing (焦磷酸测序, Biotage ) 454 Sequencing — a brand of sequencing by 454 Life Sciences, that dramatically expands pyrosequencing Sequencing by hybridization Nanopore sequencing Polony sequencing (聚合酶克隆 ) 大多数细胞内DNA处于欠旋状态 闭环DNA（closed-circular DNA ）分子接近B型结构时（10.5bp/圈）为松弛状态。 生物学来源的闭环DNA通常为非松弛状态。 细胞调节的张力诱导DNA超螺旋 闭环DNA通常处于欠旋状态 第十二节核酸的分离纯化和鉴定 一、核酸的分离、提取通则 防止核酸的降解和变性 : 防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏（一般在 pH 4-10下进行） ; 避免剧烈搅拌； 防止核酸酶（DNase , RNase ）的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： 实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑 制剂。 二、DNA的提取 改变盐浓度提取：1mol / L NaCl溶解DNP, 0.14mol/LNaCl 沉淀DNP, 酚振荡抽提去除蛋白质，沉淀DNA（乙醇、异丙醇） 蛋白酶K和SDS消化后，酚抽提去除蛋白质，沉淀DNA（乙醇、异丙醇） 氯化铯密度梯度离心 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，可利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。 分离沉淀DNA 三、RNA的提取 RNA不稳定，同时RNase无处不在，因此RNA的分离较困难。要创造一个无RNase环境 总RNA提取： 酸性胍盐（异硫氰酸胍）/苯酚/氯仿抽提 mRNA提取：oligo dT 四、核酸含量的测定 核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组成的核苷酸的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以只要测定三者中任何一处成分的含量，就可推算出核酸的含量。常用的核酸测定方法有 ： 紫外吸收法 、定磷法、定糖法 RNA的定量测定：地衣酚法 DNA的定量测定：二苯胺法 比色杯 DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于: 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 核酸纯度鉴定 A260/A280 DNA纯品: A260/A280 = 1.8 RNA纯品: A260/A280 = 2.0 电泳 五、核酸的凝胶电泳 当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸的分子量、纯度、结构变化、序列分析等 种类： 琼脂糖凝胶电泳（水平电泳） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直电泳， 分辨率可达1bp常用于测序） 组蛋白是小的碱性蛋白 2. 核小体包装的高级形式 30nm核小体纤维是核小体的高级组装 双螺旋DNA 染色质形式：核小体链 螺线管：(每圈6个核小 体)， 30 nm 核小体纤维 突环：与核骨架相连。 玫瑰花结：（18环 ， 30 梅花结为一个螺旋圈 ） 染色体： 每个染色单体 含10个螺旋圈 真核细胞染色体DNA包装好象是一次缠绕再接一次更高级的缠绕（超螺旋的超螺旋）。 DNP相 对 溶 解 度 NaCl（mol/L） 分光光度计 * 他成功地测定了病毒phiX174中的DNA分子内5375个核苷酸的排序 * In order to perform the sequencing, one must first convert double stranded DNA into single stranded DNA. This can be done by denaturing the double stranded DNA with NaOH. * In order to perform the sequencing, one must first convert double stranded DNA into single stranded DNA. This can be done by denaturing the double stranded DNA