(全)微生物综合实验2012.11.doc

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(全)微生物综合实验2012.11

《微生物学综合实验》 一、大肠菌群(M.R.N.)的测定 1、目的和要求 (1)了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义?? (2)学习并掌握大肠菌群的检验的原理和方法,以判别食品的卫生质量? 2?、原理 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染,同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 三步法:(1)发酵乳糖,产酸产气初发酵实验;(2)初发酵阳性管通过伊红美蓝平板进行分离;(3)复发酵对分离菌作证实实验 食品中大肠菌群数系以每100g(或ml)检样内大肠菌群最近似数(the?most?probable?number-简称MPN)表示。 ?最近似数(most?probable?number-简称MPN)法是一种将样品“多次(管)稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中,每个稀释度接种3支或5支。经培养后,根据结果查阅MPN检索表,就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 3?、材料 3.1?样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 3.2?菌种 大肠埃希氏菌(Escherichia?coli) 产气肠杆菌(Enterobacteria?aerogenes) 3.3?培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管(单料或双料)、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂(EMB)、革兰氏染色液、无菌生理盐水(9ML/试管,225ML/250ML三角瓶,内含适量玻璃珠)、75%酒精棉球等 3.4?其它 恒温箱、恒温水浴、药物天平、无菌培养皿、无菌吸管(1ML、10ML)、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、匀质器、载玻片等 4?、流程 样品(无菌称量25g)→稀释{温热的225ml灭菌生理盐水锥形瓶;再作1:10稀释度(即取1ml第一次稀释后的样品,加入到装9ml重量盐水的试管中);再做1:100稀释度}→接种 (各取1ml接种)(选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管)培养(24±2h,36±1℃)→初发酵结果:⊙若不产气,即为大肠杆菌阴性,报告大肠杆菌阴性。⊙若产气,划线伊红美蓝平板(18-24h,36±1℃)培养→分离结果:⊙用革兰氏染色:若为G+阳性,报告大肠杆菌阴性;⊙若革兰氏染色G-阴性无芽孢杆菌,→接种(复发酵)乳糖发酵管(24±2h,36±1℃)培养→结果:产气,报告大肠杆菌阳性;不产气,报告大肠杆菌阴性。 5?、步骤 取样及稀释,做成1:10、1:100的均匀稀释液为检样。同一稀释度接种3个乳糖胆盐发酵管,并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。 以无菌操作取检样25g(或25ml),放于225ml灭菌生理盐水的灭菌广口瓶(瓶内预置适量的玻璃珠)或灭菌研钵内,经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000—10000r/min的速度处理1min,制成1:10的均匀稀释液。 用1.0ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1.0ml,沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及吸管内液面),振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。 另取1.0ml灭菌吸管,按上操作顺序,制成10倍递增的稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1.0ml吸管。 5.1?乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管,同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。 5.2?分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂(EMB琼脂)平板上划线分离。然后置36±1℃温箱内,培养18~24小时后取出,?观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。 5.3?证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳?性。 5.4?报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数,查MPN表,报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。 6?、结果 6.1试验结果表 接种量 管号? 发酵反应结果 有无典型菌落 革兰氏染色结果

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