(全)微生物综合实验2012.11.doc

《微生物学综合实验》 一、大肠菌群(M.R.N.)的测定 1、目的和要求 （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义?? （2）学习并掌握大肠菌群的检验的原理和方法，以判别食品的卫生质量? 2?、原理 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 三步法：（1）发酵乳糖，产酸产气初发酵实验；（2）初发酵阳性管通过伊红美蓝平板进行分离；（3）复发酵对分离菌作证实实验 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the?most?probable?number-简称MPN）表示。 ?最近似数（most?probable?number-简称MPN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 3?、材料 3.1?样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 3.2?菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia?coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria?aerogenes） 3.3?培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管（单料或双料）、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、无菌生理盐水（9ML/试管，225ML/250ML三角瓶，内含适量玻璃珠）、75%酒精棉球等 3.4?其它 恒温箱、恒温水浴、药物天平、无菌培养皿、无菌吸管（1ML、10ML）、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、匀质器、载玻片等 4?、流程 样品（无菌称量25g）→稀释{温热的225ml灭菌生理盐水锥形瓶；再作1：10稀释度（即取1ml第一次稀释后的样品，加入到装9ml重量盐水的试管中）；再做1：100稀释度}→接种 （各取1ml接种）（选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管）培养（24±2h，36±1℃）→初发酵结果：⊙若不产气，即为大肠杆菌阴性，报告大肠杆菌阴性。⊙若产气，划线伊红美蓝平板（18-24h，36±1℃）培养→分离结果：⊙用革兰氏染色：若为G+阳性，报告大肠杆菌阴性；⊙若革兰氏染色G-阴性无芽孢杆菌，→接种（复发酵）乳糖发酵管（24±2h，36±1℃）培养→结果：产气，报告大肠杆菌阳性；不产气，报告大肠杆菌阴性。 5?、步骤 取样及稀释，做成1:10、1：100的均匀稀释液为检样。同一稀释度接种3个乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。 以无菌操作取检样25g（或25ml），放于225ml灭菌生理盐水的灭菌广口瓶（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振荡或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000—10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml,沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及吸管内液面),振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。 另取1.0ml灭菌吸管,按上操作顺序,制成10倍递增的稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1.0ml吸管。 5.1?乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。 5.2?分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出,?观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。 5.3?证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳?性。 5.4?报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 6?、结果 6.1试验结果表 接种量 管号? 发酵反应结果 有无典型菌落 革兰氏染色结果