61临床生化分析方法.doc

临床生化分析方法 一、分析方法分类（一）终点法被 测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点 或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终 点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲 线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法 测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 慢反应，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。1．一 点终点法 在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K。 K为校准系数，详见第五节二操作方法。 2． 两点终点法 在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4。计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K。该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸 （icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加 入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无 明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项 目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚 未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。 （二）固定时间法指 在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K。有时也称此法为两点法。 该 分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性 苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后， 碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，使肌酐浓度 与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计 算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性 段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算 ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一 般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。关于理论K值和校准K值 叙述如下： 　　 　1．理论K值　多用于酶活性测定中，因酶活