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61临床生化分析方法
临床生化分析方法
一、分析方法分类(一)终点法被 测物质在反应过程中完全被转变为产物,即达到反应终点,根据终点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法(end essay)。实际上被测物并没有完全被转变,而只是与产物达到一个动态的化学平衡,因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看,到达反应终点 或平衡点时,吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值,求出其平均值计算结果,并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终 点。终点法参数设置简单,反应时间一般较长,精密度较好。终点时间的确定:①根据时间-吸光度曲线来确定,如Trinder反应测定尿酸,反应曲 线上3~5min时其吸光度已趋向稳定,因而可将5min作为反应终点。②根据被测物反应终点,结合干扰物的反应情况来确定,如在血清白蛋白的溴甲酚绿法 测定中,白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应,之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 慢反应,使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升,持续约达10min,因此终点时间应采用10~30s,而不应选择10min。1.一 点终点法 在反应到达终点,即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值,这种方法称为一点终点法(one point end essay),其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是:待测物浓度CU=(待测吸光度AU-试剂空白吸光度AB)×K。 K为校准系数,详见第五节二操作方法。
2. 两点终点法 在被测物反应或指示反应尚未开始时,选择第一个吸光度,在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度,此两点吸光度之差用于计算结果,称为两点终点法(two point end essay),其反应曲线见图7-4。计算公式为CU=(待测吸光度A2-待测吸光度A1)×K。该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸 (icterus)和脂浊(lipo-turbid)等样品本身光吸收(见图7-5)造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加 入之初,若指示反应吸光度尚未明显变化,则可在此时选择第一个吸光度,在指示反应终点时选择第二个吸光度,从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无 明显变化的化学反应较少,如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目,及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项 目,因反应初期吸光度已有明显变化,因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中,如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前,此时指示反应一般尚 未开始,则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能,不必手工进行校正。
(二)固定时间法指 在时间-吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,这两点的吸光度差值用于结果计算,称为固定时间法(fixed-time essay),反应曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同,为CU=(A2-A1)×K。有时也称此法为两点法。
该 分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如:苦味酸法测定肌酐,反应的最初30s内,血清中快反应干扰物(如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性 苦味酸反应;在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应,且此段时间-吸光度曲线的线性较好(故也可用连续监测法测定肌酐);在80~120s及其以后, 碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间,既避免了快反应物质的干扰,也避免了慢反应物质的影响,使肌酐浓度 与吸光度变化呈良好的线性关系,有利于提高分析的特异性和准确度。(三)连续监测法连续监测法(continuous monitoring essay)又称速率法(rate essay),是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时,连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值,并以此线性期的单位吸光度变化值(ΔA/min)计 算结果,见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等,如图7-7C所示,图中δ1及δ5值偏小,而δ2=δ3=δ4,故A1点至A4点属线性 段。此线性期对底物来说属零级反应,期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度,其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算 ΔA/min,根据此值再准确地计算酶活性,因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度,一 般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性(U/L)=ΔA/min×理论(或校准)K值,代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。关于理论K值和校准K值 叙述如下:
1.理论K值 多用于酶活性测定中,因酶活
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