003 微生物限度检查法标准操作规程.DOCVIP

目的 制定检查法。检。 QC主管：监督检查本SOP执行情况。 内容 细菌、霉菌及酵母菌计数 4.1.简述 细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药用原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。 一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（colony forming unitg，CFU），而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。 在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。 4.2.设备、仪器及用具： 4.2.1. 设备 无菌室、净化工作台、生化培养箱（30-35。C）、电热恒温水浴锅、干燥箱、电冰箱、不锈钢双层立式消毒器、紫外灯等。 4.2.2. 仪器及器皿： 显微镜、电子分析天平、锥形瓶（250-300ml）、研钵、培养皿（90mm）、量筒、试管（18×180mm）及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸等。 4.2.3. 用具：大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、灭菌钢锥、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盆、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。 4.3. 试液 4.3.1. 消毒液 0.1% 苯扎溴铵溶液：供洗手、擦拭操作台面用。 75%乙醇溶液 4.3.2. 稀释剂、试剂及配制： 4.3.2.1. 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121。C灭菌20min。 4.3.2.2. 1%二盐酸二甲基对苯二胺试液：取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml即得。需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。 4.3.2.3. 40%氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g，加水使溶解100ml。 4.3.2.4. 碘试液：取碘6g与碘化钾5g，加水20ml使溶解，置密闭棕色瓶中储存。 4.3.2.5. 盐酸试液：取盐酸8.4ml，加水使稀释成100ml。 4.4. 培养基 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、明胶培养基、PDP琼脂、硝酸盐胨水培养基、蛋白胨水培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄胨水培养基 4.5. 操作方法 4.5.1. 试验前准备 4.5.1.1. 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。 4.5.1.2. 开启微生物室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。 4.5.1.3. 关闭紫外灯。QC质检员进一更，用洗手液洗手，烘干。进入二更，换工作鞋，再用0.1% 苯扎溴铵溶液洗手，穿戴洁净无菌服、帽。 4.5.1.4. 操作间先用酒精棉球擦手，再用乙醇擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 4.5.2. 供试液的制备 4.5.2.1. 固体供试品 称取供试品10g（或液体适量）,置于匀浆杯或适当灭菌容器中,加入100ml0.9%无菌氯化钠溶液,用匀浆仪(3000～5000r/2～4min),振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀,胃溶胶囊加稀释剂后置45℃±1℃水浴中振摇,肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置45℃±1℃水浴振摇溶解。 4.5.3. 细菌数测定 4.5.3.1. 供试液的稀释 4.5.3.1.1.取2-3支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开、倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）0.9%无菌氯化钠溶液的试管中混匀，即为1：100供试液。以另一支1ml吸管，按上述操作，作1：1000的稀释。 4.5.3.2.注平皿 在进行10倍（或100倍）递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取每级稀释液各1ml置每个灭菌平皿中，每一稀释级注2～3个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流至吸管尖端部。 取1支1ml吸管吸取0.9%无菌氯化钠溶液1ml注入2个平皿中，作为阴性对照。 4.5.3.3.倾注培养基 4.5.3.3.1.将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌用玫瑰红钠琼脂培养基）熔化，置45。C水浴中，备用。 4.5.3.3.2.将45。C左右的琼脂倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。 4.5.3.4. 培养