农杆菌介导法分析报告.ppt

* * 农杆菌介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 农杆菌 感染柳树 产生 冠瘿瘤 原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。 因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 Story 冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。 1907年， Smith Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。 1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不 致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。 60’s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP) 1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP 1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。 1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。 Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75 .4 um，分子质量为（90－150）×106 Da。在温度低与30℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。 Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能： 1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力； 2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力； 3、根癌农杆菌的寄主植物范围； 4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分； 5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活。 1) Ti质粒的结构 　　来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。 Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。 长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致瘤区，这个区主要合成植物 生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。 在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24 bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA。 致瘤区+冠瘿碱+左右边界=T-DNA 插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。 T-DNA 区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达. T-DNA T-DNA ： Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素, 可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿。 冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来,被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源，供根癌农杆菌生长所须。 脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的