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蛋白质与氨基酸的呈色反应-.ppt
实验一??蛋白质和氨基酸的呈色反应 一、实验目的 1、了解蛋白质和氨基酸的呈色反应原理 2、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方 法。 3、了解呈色反应在定性和定量分析中的应用。 (一)双缩脲反应1、原理?? ? 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 2、试剂(1)尿素(2)10%氢氧化钠溶液(3)1%硫酸铜溶液(4)2%卵清蛋白溶液 3、操作(1) 取少量尿素结晶,放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化,尿素放出氨 。熔化的尿素开始硬化时,停止加热,形成双缩脲。冷后,加10%氢氧化钠溶液约1ml,振荡混匀,再加1%硫酸铜溶液1滴,再振荡。观察出现的粉红颜色。添加要避免过量硫酸铜,否则,生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 (2)向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml,摇匀,再加1%硫酸铜溶液2滴,随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 (三)黄色反应1、原理 2、试剂 (1)鸡蛋清溶液????(2)头发 (3)指甲 (4)0.5%苯酚溶液 (5)浓硝酸? ?(6)0.3%色氨酸溶液????????(7)0.3%酪氨酸溶液?????????(8)10%氢氧化钠溶液????? ??3、操作? 向6个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象,有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜色变化。 2、试剂: (1) 蛋白质溶液 鸡蛋清:水=1:20 (2)冰醋酸 (3) 浓硫酸(分析纯) 3、操作 向试管中加数滴蛋白质溶液,再加冰醋酸约1ml,倾斜试管,谨慎地沿着管壁加浓硫酸(A.R.)约1ml,使其重叠,勿使两者混合。静置后,观察在两液界面上出现的红紫色环,于水浴中微热,可帮助颜色形成。 用20%白明胶作乙醛酸反应。白明胶分子中无色氨酸,所以不呈此反应。 (五)考马斯亮蓝反应1、原理考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中,其以游离存在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高,比氨基黑高3倍。反应速度快,约在2分钟左右时间达到平衡,在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内,蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 2、试剂 (1)蛋白质溶液(鸡蛋清:水=1:20)???????? 5 ml (2)考马斯亮蓝染液????????????300 ml考马斯亮蓝G250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中,加100 ml 85%磷酸混匀,配成原液。临用前取原液15 ml,加蒸馏水至100 ml,用粗滤纸过滤后,最终浓度为0.01%。 * * * 剂i] (二)茚三酮反应 2、试剂(1)蛋白质溶液?(新鲜蛋清:水=1:9)?100ml (2)0.5%甘氨酸溶液(3)0.1%茚三酮水溶液(4)0.1%茚三酮-乙醇溶液 3、操作(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml,再各加0.5ml 0.1%茚三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫色再变蓝。(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。 剂i] 剂i] 剂i] ? ? ? ? ? ? 现 象 4 4 4 40 40 2 浓硝酸(滴) 0.3% 酪氨酸 4 0.3% 色氨酸 4 0.5% 苯酚 4 头发 ? 少许 指甲 ? 少许 蛋白质 溶液 4 材 料 (滴) 6 5 4 3 2 1 管 号 剂i] (四)乙醛酸反应 1、原理 紫红色 剂i] 剂i] *
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