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ELISA标准方法 ELISA所用试剂 1. 包被液：Na2CO3: 1.6g NaHCO3: 2.9g。加双蒸水至1升，调节pH值至9.6（室温保存） 2. 5×PBS（1L）： Na2HPO4·12H2O：68.8g NaH2PO4·2 H2O：8.97g NaCl：45g 加双蒸水至1L，室温保存3—4周。 3. 洗涤溶液：含0.05％Tween20的PBS水溶液 PBST（1L）： 5×PBS：200mL ；双蒸水：800mL；10%的Tween—20：5 mL 4. 底物液： A：无水醋酸钠：8.2g β—糊精：2.5g 过氧化氢脲：150 mg 加双蒸水至1000 mL，调pH至5.0，4℃保存。（使用时需达到室温） B：TMB 50mg 溶于二甲基亚砜（DMSO） 5 mL ，室温避光保存。 使用前15分钟混合14.6 mL A液和0.45 mL B液。 5. 封闭液：1%BSA（溶解于PBS中） 6. 终止液：1.25M H2SO4 实验方法 1.半抗原与载体蛋白连接 采用活性酯法连接。以连接KLH为例，具体步骤： 精确称取半抗原活性酯10mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺DMF中（溶液1）（－20℃保存），载体蛋白10mg溶于2ml pH值为9.3的KH2PO4溶液中（溶液2），根据半抗原与载体蛋白摩尔比例为1：13，取适量溶液1缓慢加入到溶液2中，在冰浴中混合。然后放于4℃冰箱内过夜（18h），室温放置1小时后将反应液装入透析袋，4℃下、pH=7.4的0.01 mol/mL 的PBS中透析，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，加入叠氮钠（1/1000）4℃保存。 2. 酶标抗原的制备 制备半抗原的活性酯，采用方法同半抗原与载体蛋白连接方法(1)相同，只是收集透析后的液体中加入硫柳汞（1/10000），4℃保存。 3.免疫程序 免疫动物选择雄性新西兰大白兔（活雄性大耳白），月龄3个月，体重1.5公斤，饲养于标准实验动物房中，连续观察3天，确定身体状况正常后进行免疫。 精确称取0.2ml人工抗原（5mg/ml）溶于0.3mL 0.9％的NaCl溶液；与0.5mL弗氏完全佐剂乳化后初次免疫，采用多点皮内和肌肉注射。加强免疫用0.1ml人工抗原溶于0.4mL 0.9％的NaCl溶液和0.5mL弗氏不完全佐剂乳化后免疫。分别于初次免疫后2周、4周、8周、12周、16周共加强免疫五次，分别于第三、四、五、六次免疫完后10天，由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测。 4. 抗血清效价的测定：间接酶联免疫法 包被抗原（与载体蛋白OA连接物）1ug/well，室温过夜；PBST洗板三次后加入1％BSA/PBS 200uL/well室温封闭1h；PBST洗板三次后加入50uL/well梯度稀释的抗血清，室温孵育1h；PBST洗板四次后加入50uL/well酶标二抗，室温孵育30min；PBST洗板五次后加入TMB底物体系150uL/well，室温显色反应20min；加入1.25M浓硫酸50uL/well终止反应。酶标仪读数，选择吸光度值在0.7－1.2范围内的抗血清稀释倍数，即为抗体效价。 5. 抗体的纯化：ProteinA－Sepharose 4B亲和层析法 用磷酸缓冲液平衡柱子，流速1mL/min；用磷酸缓冲液稀释抗血清后上柱，流速0.5mL/min。IgG（免疫球蛋白）被ProteinA－Sepharose 4B吸附，其他杂蛋白随缓冲液流出；用磷酸缓冲液冲洗柱子，280nm检测，当基线平衡后用甘氨酸盐酸pH2.7缓冲液洗脱IgG，流速0.5mL/min。收集洗脱液，迅速用1M Tris-Cl pH 9.1中和抗体，用PBS透析三天。 6. ELISA试剂工作浓度的优化 6.1抗体包被浓度的确定 根据实验经验，选用几种抗体浓度进行包被，固定酶标浓度，采用不同标样浓度进行直接竞争ELISA，绘制抑制率曲线 6.2酶标抗原浓度的确定 以优化后的抗体包被浓度包板，固定游离抗原浓度，将酶标记物以不同稀释度稀释，进行ELISA分析，确定适宜的酶标记抗原浓度。 选择吸光度值在0.7-1.2之间的酶标浓度为实验的酶标浓度。 7．直接竞争ELISA检测方法 抗体以包被液稀释包被96孔酶标板，100μL∕well，室温孵育整夜；PBST洗板3次；封闭液（200μL∕well）封闭1h；PBST洗板3次；加入标样或样品和酶标抗原，各100μL∕well，室温孵育1h；PBST洗板3次；加TMB底物液150μL∕well；室温反应30min后，加50μL∕well终止液终止反应；酶标仪波长450nm，650nm下读数