南方医科大学细胞生物学第二章方法探究.ppt

* * * * * 第一节 显微镜技术 光学显微镜 : 观察显微结构 （light microscope) 显微镜 电子显微镜 : 观察亚微结构 (electron microscope) 第二章.细胞生物学研究方法 分辨率公式 n = 介质折射率（空气1，水1.33，香柏油1.5） θ= 标本对物镜镜口张角的半角， sinθ的最大值为1。 λ= 照明光源的波长，白光0.5 ?m 。 横向分辨率 Rx,y=0.61λ/n·sinθ 纵向分辨率 Rz=2λ/(n·sinθ)2 退 出 Technology for Cell Biology 首 页 (一)普通光学显微镜的分辨率：0.2微米 一、光学显微镜技术 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ 人眼的分辨率：100 ?m 不同光线的波长 名 称 波 长 (nm) 可见光 760 - 390 紫外光 390 - 13 X 射线 13 - 0.05 γ射线 1 - 0.005 电子束 : 100V 0.123 10,000V 0.0122 100,000V 0.00387 （二）普通光学显微镜的成像原理 光镜的结构 ①光学部分 ②照明部分 ③机械部分 在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易看清。 往往将标本切片进行染色——提高可辨程度。 移动臂 蜡或树脂包埋的样品 切片用钢刀 样品切片蜡带 伸展在盖玻片和 载玻片之间的切片 切片机 染色的原理 未染色 已染色 （三） 荧光显微镜 以紫外线为光源，照射被检物体发出能观察到的荧光。 荧光显微镜显示同一细胞中的多种结构成分 细胞核 内质网 细胞骨架 （四）相差显微镜 通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快 相位差 (光程差) 振幅差 (明暗差) 相差显微镜 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 倒置相差显微镜 载物台的上方： 光源 长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察 体外培养的细胞　 (a)：正在分裂生长的Hela 细胞 (b)：CHO单层细胞的培养 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 (五)激光共聚焦显微镜 信噪比 英文名称： signal-to-noise ratio; signal to noise ratio 定义： 特定参数(信号)值与非特异性参数(噪声)的比值。 如实验中样品的放射性与本底放射性强度之比；荧光在X射线底片上所造成的感光强度与非特异感光背景强度之比等 二、电子显微镜 1.透射电子显微镜 分辨率= 0.1 nm 2.扫描电子显微镜--标本表面的三维结构 显示细胞表面三维立体结构 显示细胞断面三维立体结构 电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM TEM 200nm 100nm 0.1nm 可见光（400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 玻璃透镜 玻璃透镜 电磁透镜 不要求真空 不要求真空 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 一.细胞组分的分级分离 第二节.细胞生物学其他研究方法 分离不同类型细胞 大小 密度 形状 小 轻 不规则 大 重 圆形 1.差速离心法 方法：从高速到低速逐级沉降 分离对象：体积、质量差别较大的颗粒 二 细胞培养 （一）细胞培养 从机体中取出组织或细胞，模拟