乳酸细菌于干酪生产.docVIP

乳酸细菌于干酪生产 乳酸细菌的肽酶 乳酸细菌在干酪后熟中的作用 乳酸菌在乳品发酵中起着十分重要的作用，并对产品的质量和保藏有很大的影响。乳酸菌最主要的作用是将乳糖转化为乳酸，降低PH，并通过水解蛋白质，释放短肽和游离氨基酸，影响乳制品的风味和品质。 乳球菌是干酪生产中广泛使用的发酵剂，与凝结剂、乳内源酶一起参与酪蛋白的转化。酪蛋白水解是干酪成熟过程中品质和风味形成的关键。未产生料号的风味，干酪需要较长的成熟期。在干酪生产中除了作为发酵剂的乳酸菌外，还有一些非发酵剂乳酸菌（NSLAB），NSLAB能减少苦味，增加游离氨基酸含量，促进干酪成熟，NSLAB产生的氨肽酶具有降解苦味肽的能力，可降干酪苦味。目前添加高活性蛋白水解能力的乳杆菌已被用来增强风味，缩短干酪成熟期。 一般而言，乳制品中游离氨基酸和小肽浓度较低，乳酸菌生长时难以达到较高菌体密度，但乳酸菌能依靠自身蛋白水解系统将乳蛋白降解为有利氨基酸以满足生长需要。乳酸菌的蛋白水解系统包括蛋白酶、酶结合运输系统以及细胞质肽酶，对形成干酪风味和质构非常重要。乳球菌和乳杆菌是干酪生产中广泛使用的发酵剂，在乳酸菌中发现有10多种不同类型的肽酶，并从乳酸菌和乳杆菌中克隆到多个肽酶基因。瑞士乳杆菌（lactobacillus helveticus）中的大多数肽酶，在乳酸乳球菌中均有相同类型的对应物。但瑞士乳杆菌的总蛋白水解活性要比乳酸乳球菌高。因此在用其他发酵剂加工干酪时，常常加入瑞士乳杆菌作为风味添加剂。有利氨基酸不仅与形成干酪基本风味有关，二姐还是形成芳香物质的前体。瑞士乳杆菌的蛋白质水解酶不仅可缩短干酪成熟时间，还可用于生产新风味的干酪，改善低脂干酪的品质。 对肽酶在分子水平上的研究，使其在不同乳酸菌中异源表达成为可能。如将瑞士乳杆菌编码氨肽酶N(PEPN)、氨肽酶C（PEOC）、X—脯氨酰二肽氨基肽酶（PEPD）的基因分别克隆到乳酸乳球菌MG1363中，研究这些基因在乳酸乳球菌中的表达能力。Luoma（2001）将瑞士乳杆菌的肽酶基因科龙到乳酸乳球菌中，研究蛋白水解活性的变化。讲工业用瑞士乳杆菌53/7中的肽酶基因pepN、pepX、pepC、pepI、pepD和pepR分别克隆到乳酸乳球菌及其肽酶突变株中，构建具有新型能的生产菌株。 肽酶的作用 瑞士乳杆菌肽酶pepN和pepC的底物是L-赖氨酸对硝基苯胺，pepI的底物是L-脯氨酸对硝基苯胺，pepX的底物是L-甘氨酸-脯氨酸对硝基苯胺，pepD的底物是亮氨酸-亮氨酸，pepR的底物是脯氨酸-亮氨酸。通过酶和底物的作用，对肽酶进行分析研究。 乳杆菌能水解酪蛋白，给菌体提够生长必需的氨基酸，通过构建单个和多个肽酶缺失突变体，可以了解肽酶对乳酸乳球菌生长的影响，由于突变体不能凤姐酪蛋白，会导致菌体在乳中生长缓慢，这说明了太美的重要性。 在含葡萄糖的M17（GM17）培养基上，各个菌株的生长曲线无显著差异。在牛乳中生长时，乳酸乳球菌肽酶突变株的数量减少。瑞士乳杆菌pepN（Pkth2172）能使肽酶突变株恢复或接近野生型君主的生长水平，这表明生长缺陷乳酸乳球菌太没突变株可用相应的瑞士乳杆菌基因补充。瑞士乳杆菌pepN能补充乳酸乳球菌的5种肽酶缺陷型，这与pepN广谱的水解能力相一致。但瑞士乳杆菌的pepX或pepC不能使MG1363[XTOCN]突变菌在牛乳中正常生长。在含pepN、pepX、pepC、pepI的重组子的酶活增高，而含有pepD和pepR的重组子的酶活没有变化。在GM17和牛乳中的两种培养基中pepN的活性均约为1U/mg蛋白。在低拷贝数数载体中，瑞士乳杆菌的肽酶基因（pepN）的表达水平最高，与野生型乳酸乳球菌相比，pepN的活性增加了25倍。 在GM17培养基中，重组子pepX的活性是宿主乳球菌pepX的5倍，而在牛乳中重组体活性显著下降。在GM17和牛乳中重组体的pepC活性均是宿主菌株的2倍，而pepI在GM17和牛乳中的活性几乎相同。 无论是在野生型还是在肽酶负突变株乳酸乳球菌中，瑞士乳杆菌pepN、pepX、pepC转录水平无显著差异。pepN在乳酸乳球菌中的转录产物是在瑞士乳杆菌中的10倍，而pepX、pepC在乳酸乳球菌中的转录水平比瑞士乳杆菌中低。不是所有来自瑞士乳杆菌肽酶的启动子都能在乳酸乳球菌中起作用，有些启动子在乳酸乳球菌中不能识别，这与两者的启动子共有序列不同有关。对pepD和pepR在PnisA控制下的表达进行研究，当nisin浓度为5ng/ml时，重组体中肽酶活性最高，但nisin浓度继续增加会导致生长受阻和太没活性下降。Wegmann(1999)在PnisA控制下，成功地讲德氏乳杆菌乳亚种的4个肽酶基因pepI、pepL、pepW、pepG在乳酸乳球菌中