DNA的基本分子生物学操作例析.ppt

DNA的基本分子生物学操作（表达载体的构建） 胥慧 2009.9 如何研究某个基因的功能? 遗传学 突变体 基因缺失或下调 过量表达 体内/体外生化反应 表达载体的构建 表达载体构建流程 零、策略的设计 一、PCR扩增基因 二、乙醇沉淀基因 三、酶切基因及载体 四、琼脂糖凝胶电泳回收基因及载体 五、连接 六、转化大肠杆菌 七、质粒的小量提取 八、PCR/酶切鉴定及测序 九、质粒的大量提取 查找基因 设计引物 引物长度：18-22 nt GC含量 （DNAMAN hybrid: 50~60℃） DNAMAN检查：游离3’端 8 bp 以G/C结尾 酶切位点的选择 （巧用平端酶） 保护碱基 负义链引物注意反向 考察是否移码 一、PCR（Phusion / Taq） 5 X HF buffer: 10 μl NEB dNTPs: 0.5 μl Phusion: 0.4 μl Primer 1: 0.5 μl Primer 2: 0.5 μl Template: 1 μl ddH2O: 37.1 μl 98℃ 1 min 98℃ 10 sec 25 X 55℃ 30 sec 72℃ 1 min 72℃ 10 min 10℃ ∞ 一、PCR 10 X PCR buffer: 5 μl MgCl2: 3 μl dNTPs: 0.5 μl Taq: 1 μl Primer 1: 0.5 μl Primer 2: 0.5 μl Template: 1 μl ddH2O: 38.5 μl 94℃ 5 min 94℃ 30 sec 30 X 55℃ 30 sec 72℃ 2 min 72℃ 10 min 10℃ ∞ 问题篇 P不出来： 从自己操作检查起；负义链引物是否忘记反向了；退火温度是否合适（考虑降温）；换模板；换Taq试；重设引物。大于5 kb的基因考虑分两段。 量太少： 增大模板量；降温；多P几管。 非特异条带： 若目的条带比非特异亮，大胆升温；若非特异比目的带大，严格控制延伸时间；胶回收目的带作模板再PCR。 大小不对： 温度；模板；重设引物。 二、乙醇沉淀DNA 1. 合并PCR产物，用TE buffer将体系扩大至 200 μl，混匀。加入2~2.5 V无水乙醇、1/10 V醋酸钠(3M, pH 5.2)，混匀。 2. 置于-80℃ 30 min以上,或者，液氮速冻。 3. 4℃ 12000 rpm离心15 min，倒掉上清。 4. 70%乙醇洗沉淀，吸尽上清，烘干。 5. 以适量ddH2O溶解DNA。 三、酶切 做酶切前必须研究NEB产品目录！ 三、酶切 25度的 50度的、60度的…… 三、酶切 酶切反应体系 50 μl体系 5 μl体系 buffer 1/2/3/4/U : 5 μl 0.5 μl DNA: x μl a μl Enzyme: 1.5~2 μl 0.3 μl ddH2O: 补足 三、酶切 反应的温度: 大多数酶的最适反应温度是37℃。 25℃酶：ApaI SmaI 50℃酶： 反应时间: （NEB快速酶切产品: 5 min） 一般2 h。 若切末端的几个碱基，延长时间。 研究NEB产品目录！ 三、酶切 三、酶切 双酶切 不同反应温度的酶不可以作双酶切。若两者buffer相同，先切低温酶，再切高