冻存袋验证研究.doc

2.0 执行摘要 在此代表Charter医学公司（CM），开展本项验证研究。CM要求PCT公司设计并实施一项研究，以便对如下情况进行论证：即经过液氮（LN）中的液相长期低温冻存（名义保存期至少为6周）后，Cell-Freeze?低温冻存袋的物理完整性以及袋内低温保存的造血祖细胞（HPC）的质量，仍可继续得以维持。按照VP-P008的A修订版验证方案，在PCT公司的Hackensack设施内开展研究。 在VP-P008方案的实施过程中，总共出现6次过程偏离，其中包括：（DEV-01），变更冷冻速率控制程序的设置，（DEV-02）；某些储存袋的注射器接头在充装培养肉汤过程中折断；（DEV-03、DEV-04、DEV-05），储存袋LN保存中暴露气温时出现温度监测偏差；以及（DEV-06），因人为失误（即冷冻袋在融化过程中从工作台掉落至地板上）所导致的1个储存袋破裂。这些偏离均可认为对本研究所得结论无影响。 Cell-Freeze?低温冻存袋的物理完整性：以CML-100LN冻存袋为整套Cell-Freeze?冻存袋之代表产品，这种冻存袋由CM公司生产并投放市场，用于低温保存HPC。选择该型号冻存袋为代表产品的依据为，它是所有冻存袋设计之代表，其塑料胶膜的型号最大，密封线也最长，进而较更小的冻存袋更有可能会破裂。这种冻存袋的充装量为130ml。方案执行过程中，采用了3个不同生产批次的CML-100LN冻存袋（总共135个冻存袋）。每个冻存袋充装内含10%DMSO的大豆胰蛋白酶肉汤（TSB），于控速冷藏箱（CRF）中冷冻，之后于LN的液相中低温保存42天。在整个储存间隔期内，每个冻存袋在融化之前均经过多次气温暴露。所有的CML-100LN冻存袋均通过了所开展的物理完整性测试，包括最初的加压测试和肉眼检查，以及随后的微生物激发和染料浸泡测试。基于参考之目的，除CML-100LN冻存袋之外，还对25只Baxter CryocyteTM R4R9955冻存袋（1个批次，充装量100ml）进行了测试。所有的CryocyteTM均通过了加压测试和染料浸泡测试；但是，有1只冻存袋在微生物激发测试中出现细菌生长。然而，所检出的微生物为枯草芽孢杆菌，而非激发细菌（缺陷短波单胞菌），提示该冻存袋未破裂。该冻存袋的芽孢杆菌污染，很可能是操作者在充装冻存袋时违反无菌操作程序的直接反映。 Cell-Freeze?低温冻存袋中冻存的HPC细胞的质量：采用最小型号的Cell-Freeze?冻存袋，即CML-50LN冻存袋代表为整套Cell-Freeze?冻存袋。选择袋体设计型号最小的冻存袋为代表的依据为，尽可能减小HPC产品的体积以完成所需的细胞质量研究。VP-P008方案执行过程中，采用了3个批次的CML-50LN冻存袋（总共25个冻存袋）。每个冻存袋充装65ml的、内含10%DMSO的、稀释后的HPC产品，每ml含有4.64×106个有核细胞（NC）。以CRF冷冻CML-50LN冻存袋，于LN的液相中低温保存42天至43天。融化之后的冻存袋再进行加压泄漏测试和肉眼检查。以流式细胞法测定存活的单个核的细胞（MNC）以及CD34+细胞的绝对数量，并以Methocult?培养基培养法促进造血细胞系中集落生成单位（CFU）的生长。除1只冻存袋的袋体在内容物测试前因人为失误导致其破裂[该冻存袋在融化时掉落到地板上，随后破裂，（参见DEV-06）]，从而无法进行完整性测试之外，所有的冻存袋均通过了加压测试和泄漏检查。所有的冻存袋均符合VP-P008方案中所规定的验收标准，即相对于冷冻保存前的样品中的细胞数目，MNC以及CD34+细胞的回收率均大于等于70%。MNC及CD34+细胞的平均回收率分别为81%（SD=6%，范围70%至94%）和84%（SD=7%，范围71%至97%）。就CFU而言，所有的冻存袋均可产生CFU，符合≥1CFU的验收标准，其平均回收率为78%（SD=27%，范围37%至140%）。作为参考，还对25只Baxter CryocyteTM R4R9955冻存袋（1个批次，充装量70ml）进行了与CML-50LN冻存袋的并行测试。所有的CryocyteTM冻存袋均通过细胞质量的验收标准，其活性MNC、CD34+细胞和CFU的平均回收率分别为81%（SD=4%，范围72%至91%）、83%（SD=7%，范围70%至96%）和80%（SD=16%，范围44%至114%）。 总而言之，本研究表明Cell-Freeze?低温冻存袋满足VP-P008验证方案所规定的物理完整性和细胞质量保持性方面的所有验收要求。 3.0 目的 本报告的目的在于，对由PCT公司代表Charter医学公司（CM）所开展的Cell-Freeze?低温冻存袋验证研究进行总结，并得出结论