DNA重组及重组DNA技术幻灯片.ppt

一、重组DNA技术广泛应用于生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面 疾病相关基因的发现与鉴定 转基因和基因打靶 加速了人类基因组计划的完成 疾病的基因诊断和基因治疗 * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的分离获取——分 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA (见第20章) PCR法 (见第20章) 其他方法 (见第20章) 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T （二）载体的选择与构建——选 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 目的： ① 获得某一目的基因或DNA片段 ② 获得目的DNA片段所编码的蛋白质 载体 插入DNA片段 宿主细胞 质粒 5~10kb 细菌，酵母 λ噬菌体载体 ~20kb 细菌 黏粒 ~50 kb 细菌 BAC ~400kb 细菌 YAC ~3 Mb 酵母 不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞 （三）目的DNA与载体连接——接 方式：（1）单一相同黏端连接 （2）不同黏端连接 （3）通过其他措施产生黏端进行连接 黏端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 单一相同黏端连接 不同黏端连接（定向克隆） Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头(linker)连接 通过其他措施产生黏端进行连接 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 在末端转移酶(terminal transferase