生物技术实践专题要点.doc

华 中 师 范 大 学 论文题目： DNA测序技术及其应用 年 级: 2014 学 号: 2014171527 姓 名: 黄慧贞 专 业: 生物学科教育 刘德利 生物技术实践专题 DNA测序技术及其应用 黄慧贞 2014172527 老师：刘德利 摘要:DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。从1977年第一代测序技术的出现,经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展,以高通量为特点的第二代测序技术步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。本文简单介绍每一代测序技术的特点,并重点介绍了第二代测序技术及其应用。同时展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。 关键词：第一代DNA测序技术；第二代DNA测序技术；第三代DNA测序技术 1.DNA测序技术的介绍 生物的DNA碱基序列蕴藏着全部遗传信息。破解这些生命天书，对于阐明生命活动秘密无疑是至关重要的。对生物基因组进行完全测序是基因组学研究的重要方向，也是生命科学研究的核心领域。 1944 年，Avery 通过肺炎双球菌转化实验证明DNA 是遗传信息的载体[1] . 此后，人们一直致力于DNA结构和序列研究, 使得 DNA 测序技术应运而生该技术对探索生命奥秘,治疗疾病,以及整个生物科学乃至医学的发展起到了巨大的推动作用。并具有广阔的应用前景。 1.1第一代DNA测序技术 较蛋白质与RNA测序技术,DNA测序技术出现较晚.1977年，Sanger发明了双脱氧链终止法 (ddNTP) 的DNA测序技术[2],同年Maxam 和Gilbert也报道了利用化学降解法进行DNA测序[3]. Sanger法测序的原理是在反应体系中加入一定比例的23一双脱氧核苷酸(ddNTP)，由于双脱氧核苷酸没有3-OH，且DNA聚合酶不能区分dNTP与ddNTP，所以当双脱氧核苷酸被聚合到链的末端，DNA链就停止延长。Sanger法操作简单，后来的DNA测序技术大部分都是在此基础上发展起来的。化学降解法的原理是，先对DNA末端进行放射性标记，再使用特殊的化学试剂进行降解，这些化学试剂均能对1个或者2个碱基发生专一性断裂，最后通过聚丙烯酞胺凝胶电泳、放射性自显影技术读取待测的DNA片段。化学降解法程序复杂，后来逐渐被Sanger法代替。这2种方法都需要放射性同位素标记，操作繁琐，不能自动化，不能满足大规模测序的要求。 到了20世纪80年代末，研究人员逐渐利用荧光标记代替同位素标记测序，产物经过平板电泳分离，荧光分子在激光的激发下可以发射出不同波长的荧光，根据荧光信号可以确定DNA序列[4]。1985年，Smith等利用激光激发标记荧光，测序速度比常规力一法提高了数倍[5]。但是这种技术依然使用平板凝胶电泳，还是比较费时费力。到了20世纪90年代，毛细管电泳技术及微阵列毛细管电泳技术被应用于DNA测序[6]。这一技术的出现提高了测序的通量，加快了人类基因组计划的完成[7]。但是毛细管阵列DNA测序在成本与耗时力一面远远满足不了基因组学发展的需要[8]，想获得突破必须寻找新的测序方法。 1.2第二代测序技术 近几年，DNA测序技术获得突破式发展。以高通量、低成本为主要特点的第二代测序技术己经广泛应用于基因组学的研究，并产生了重要影响。第二代测序技术也称为新一代测序技术,主要包括Solexa测序技术、454测序技术和SOLiD测序技术[9]。以下对3种技术分别作介绍。 1.2.1 Solexa测序技术 Solexa测序技术是目前性价比最高、应用最广泛的测序技术。Solexa测序的核心技术是DNA簇和可逆性末端终结 [10]，测序原理是边合成边测序。测序的基本流程[11-12]: (1)构建测序文库。提取基因组DNA，随机打断成100～200bp片段，末端加上接头； (2)桥式扩增。解链后的单链DNA片段两端被分别固定于芯片上，形成桥状结构，进行桥式PCR扩增。经过PCR扩增，产生数百万条待测的DNA片段，随后被线性化； (3)测序。将荧光标记的dNTP、聚合酶、引物加入到测序通道启动测序循环。DNA合成时，伴随着碱基的加入会有焦磷酸被释放，从而发出荧光，不同碱基用不同荧光标记，读取到核苷酸发出的荧光后，将3’羟基末端切割，随后加入第2个核苷酸，重复第一个核苷酸的步骤，直到模板序列全部被合成双链DNA。 1.2.2 454测序技术 454测序技术突出优点是读长长，但是准确率低，成本高。测序具体步骤[13]： (1)构建测序文库。将基因组DNA打碎成300～800个碱基