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左玉玲论文电子版新左玉玲论文电子版新
分类号：S852 密级： UDC：
青岛农业大学
硕士学位论文
马铃薯卷叶病毒重组CP的获得及其
多克隆抗体的制备
Obtainning of Recombinant CP of Potato Leafroll Virus and Preparation of its Polyclonal Antibody
研究生姓名：左 玉 玲
导 师 姓 名：郭 宝 太 教 授
专 业：生物化学与分子生物学
研 究 方 向：植物分子生物学与基因工程
中国·青岛
2009年6月
Obtainning of Recombinant CP of Potato Leafroll Virus and Preparation of its Polyclonal Antibody
Thesis submitted to
Qingdao Agricultural University
In fulfillment of the Requirement
For the Degree of
Master of Science
Zuo Yuling
（College of Life Sciences）
Supervisor: Guo Baotai
Qingdao, China
June, 2009
目 录
摘 要 1
Abstract 3
前言 1
1 马铃薯病毒及类病毒 1
1.1 马铃薯X病毒 1
1.2 马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒 2
1.3 马铃薯S病毒 2
1.4 马铃薯卷叶病毒 2
1.5 马铃薯纺锤块茎类病毒病 3
2 马铃薯抗病毒途径及抗病毒育种 4
2.1 马铃薯抗病毒途径 4
2.2 马铃薯抗病毒病育种 4
3 马铃薯卷叶病毒基因工程的研究进展 5
3.1 复制酶基因介导的抗病性 5
3.2 CP基因介导的抗病性 6
3.3 核酶介导的抗病性 6
3.4 反义RNA介导的抗病性 6
4 马铃薯病毒检测技术 7
4.1 生物学方法 7
4.2 电镜鉴定法 7
4.3 分子生物学方法 8
4.4 免疫学检测方法 9
5 病毒抗血清的制备 12
5.1 以病毒粒体为抗原制备抗血清 12
5.2 以重组CP为抗原制备抗血清 12
研究的目的和意义 13
材料与方法 15
1 材料 15
2方法 15
2.1 lacZ 基因转化酵母及其表达的诱导 15
2.1.1 酿酒酵母感受态的制备 15
2.1.2 lacZ 基因表达载体对酵母的转化 15
2.1.3 lacZ基因表达的诱导与检测 16
2.1.4 lacZ基因表达条件的比较 16
2.2 引物的设计与合成 16
2.3 PLRV-CP基因酵母表达载体的构建 16
2.3.1 PCR扩增 17
2.3.2 PCR产物的回收 17
2.3.3 目的基因片段与酵母起始表达载体的T-A连接 17
2.3.4 大肠杆菌TOP10F′的转化 17
2.3.5 阳性克隆的筛选与鉴定 18
2.3.6 酿酒酵母感受态的制备与转化 18
2.3.7 pYES-LPCP对酵母的转化 18
2.3.8 pYES-LPCP酵母菌落PCR检测 19
2.4 PLRV-CP缺失基因酵母表达载体的构建及基因表达的诱导与检测 19
2.4.1 PLRV-CP缺失基因酵母表达载体的构建 19
2.4.2 PLRV-CP缺失基因重组体的筛选 20
2.4.3 DNA序列测定 20
2.4.4 酵母表达载体的蛋白诱导 20
2.4.5 酵母表达载体蛋白提取 20
2.4.6 SDS鉴定 20
2.5 PLRV缺失突变CP基因的原核表达及重组CP的制备 21
2.5.1 基因表达的诱导 21
2.5.2 包涵体的提取 21
2.5.３ 重组蛋白的纯化 22
2.5.４ 蛋白的透析、浓缩与定量 22
2.6 重组CP抗血清的制备 23
2.6.1重组CP抗血清的制备 23
2.6.2 抗血清效价的测定 23
2.7 抗体的分离与纯化 23
2.7.1 IgG 的分离 23
2.7.2 IgG的纯化(Protein G亲和层析柱) 24
2.7.3 抗体的间接ELISA检测 24
2.8 抗体的酶标 24
2.8.1 IgG的碱性磷酸酶标记 24
2.8.2 ELISA直接法测酶标抗体活性。 25
2. 9 PLRV的DAS-ELISA检测 25
结果与分析 26
1 lacZ基因对酵母的转化及其表达的诱导与检测 26
2 PLRV-CP基因酵母表达载体的构建及其表达诱导 27
3 PLRV缺失突变C
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