第八章荧光免疫技术..doc

第八章　荧光免疫技术 第一节 概述 　　　　一、荧光的基本知识　　1、荧光 　　荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。 　　2、发射光谱 　　发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度。激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。 　　3、激发光谱 　　激发光谱是指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 　　4、荧光效率 　　荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。 　　荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）/吸收光的光量子数（激发光强度）。　　5、荧光寿命 　　荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。 　　激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质的荧光寿命不同，可利用延时测定的方法消除某些短寿命荧光的干扰，此为时间分辨荧光免疫测定的理论基础。 　　6、荧光淬灭 　　荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、Ⅰ-、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。 　　7、荧光偏振 　　P=FH-FL／FH+FL　　式中：P表示偏振度,FH表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度，FL是上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度。 　　当P=0时，说明完全不偏振；P在-1～+1之间即为部分偏振。 　　　　二、荧光物质　　（一）荧光色素　　能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物称为免疫荧光色素或荧光染料。 　　1、异硫氰酸荧光素（FITC） 黄绿色荧光 为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。 　　2、四乙基罗丹明（RB200） 橘红色荧光 为橘红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。　　3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 橙红色荧光 最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。 　　4、藻红蛋白（R-RE） 橙色荧光 本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。　　（二）其他荧光物质　　1、镧系螯合物 　　其中以Eu3＋应用最广。Eu3＋螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。 　　2、酶作用后产生荧光的物质 　　某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。 　　 第二节 荧光抗体技术 　　　　一、荧光抗体的制备　　荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。 　　（一）抗体要求 　　将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。 　　用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。 　　（二）荧光素要求 　　实验室最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素。作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。　　（三）抗体的荧光素标记 　　1、搅拌法 此法适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。　　2、透析法 适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC的0.01mol／L pH 9.4的碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法