沉淀反应6..ppt

电泳原理 pH8～8.6 缓冲液中 阴粒离子多 等电点pH3～4 分子量较小 等电点pH5～6 分子量较大 阴粒离子少 向正极电泳力小 向正极电泳力大 1.电场强度：恒定电流2～4mA/cm,恒定电压2～10V/cm 4.电渗作用：在电场中液体相对于固体的移动。 2.溶液pH值：缓冲液偏碱性，蛋白质带负电荷 3.离子强度：高，泳动慢；低，泳动快，缓冲能力↓ 0.05mol／L、pH8.6的巴比妥缓冲液 电渗作用 带负电的琼脂 静电感应 - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + A V0 - - - - - - - - - - - V 一）、对流免疫电泳 (counter immunolelctrophresis,CIEP) (一) 原理 在pH8.6的琼脂凝胶中： 　抗体球蛋白：带少量负电荷且分子较大，因此电泳力＜电渗力，泳向负极，放(+)； 　抗原蛋白质：带较强负电荷且分子较小，因此电泳力＞电渗力，泳向正极，放(－)； 　电泳一定时间后，二者相向运动，形成肉眼可见的沉淀线。 示意图 I=3～4mA/cm、30min + 1：Ag与Ab对应； 2：Ab＞Ag，Ag为 弱阳性 3：Ag＞＞＞Ab， Ag强阳性 4：Ag＞＞Ab，Ag含量较高； - 1.2%巴比妥琼脂凝胶 (三) 方法评价 简便、快速； 敏感度较双相琼脂扩散试验高8~10倍， 但分辨力较其低； 　可测出ug/ml级的蛋白质； 　目前已不推荐使用。 三、火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIE) 单向免疫扩散 + 电泳技术 原理 ＋ － Ab Ag 峰形高低与抗原量成正比 1.制板： 56度将抗体混于凝胶中　　 2.打孔： 3.加样 　 4.电泳： 抗原向正极泳动 5.观察沉淀峰 6.绘制标准曲线 + 6～8mm 5mm 沉淀峰高 抗原浓度 1.测定沉淀峰高度 2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度 标准曲线 标准曲线 2.琼脂应为无电渗或电渗很小 1.电泳顶部云雾状或 圆形，应继续电泳 3.标本 多时，应将琼 脂板置于电泳槽 上，搭桥并开启 电源后加样，否则 形成宽底。 4.IgG在pH8.6的 缓冲条件下净 电荷为零，因 此需经甲醛 化处理 注意事项 （四）方法评价： 与双扩比较： 敏感 较单扩散敏感10-16倍（达ug/ml以上） ； 快速 仅需1h左右。 但敏感度仍不高, 方法繁琐, 影响因素较多。 用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测。 (一) 原理 观察沉淀弧 根据沉淀弧的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。 双相免疫扩散： 区带电泳： 电泳 抗原 抗体 四、免疫电泳(immunoelectrophoresis,IEP) (二) 操作步骤 莊榮輝 (1985) 博士論文. p.81 + - c c 染色脫色 1.制板、打孔、加样 2.电泳 1.5-2h(4-6V／cm) 3.打槽加抗血清 4.孵育 37℃ 24h 5.染色脱色观察 观察结果 （三）方法评价： 　1.为定性实验； 　2.扩散时间长，沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响，结果较难分析； 　3.免疫电泳分辨率高，可分出人血清中20~30种抗原成分，可鉴定混合抗原中各组分。 四）免疫固定电泳 (immunofixation electrophoresis,IFE) （一）原理： 将血清蛋白在载体上电泳分离后，将抗血清直接加于其表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。 + - 37℃ 30min (二) 操作步骤 电转移 + - + - + - + - + - + - 抗IgG 抗IgA 抗IgM 抗λ轻链 抗κ轻链 抗人全血清 作用30min 染色观察 　左图为IgG κ型, 中图为IgG λ型，右为正常 SP G A M κ λ SP G A M κ λ SP G A M κ λ 免疫固定电泳示意图 （三）评价： 1.分辩力强、敏感度高、快速仅需数小 时，结果易分析； 2.主要用于M蛋白的鉴定与分型。 1.什么是沉淀反应？ 2.沉淀反应的特点？ 3.免疫浊度法的原理、方法与分类？ 4.单向扩散试验的原理和应