蛋白质结合相互作用及研究方法.pptVIP

Far western 印迹中使用的检测方法：方法1快速简单易行，并且因磷酸化位点位于蛋白质的融合部分而对蛋白质的后续活性影响很小。试剂盒的出现方法3相对容易，然而可能对探针蛋白和其它蛋白质的相互作用有影响。后两种方法的优点是没放射性但买抗体和检测试剂的成本很高。 * 蛋白芯片通常分为两类：正相蛋白芯片和反相蛋白芯片 正相芯片 将抗体，aptamer（指能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸）或其它蛋白固定在载玻片或者其它相似介质上，检测样本中蛋白量。 ProtoArray?人源蛋白芯片，用于鉴别针对超过9000余种全长天然蛋白的自身抗体的存在。 反相芯片 是把样品固定在固体支持物上，将单个可溶的探针如抗体溶液与芯片孵育，用于分析检测在不同样品中目的蛋白的存在与否。 十、等离子表面共振技术 (surface plasmon resonance ,SPR) ——适合于多种类型分子并且无需借助标记物可以实现对复合物直接实时测定的方法 SPR angle 450? gold layer p-PolarizedLight SPR现象 表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 等离子表面共振技术 基本原理：基于表面等离子共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜（传感芯片）。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。仪器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。 Biacore系统 三个核心部分： 传感器芯片， SPR光学检测系统， 微射流卡盘 SPR技术特点 无需标记，避免了费时而昂贵的纯化和标记 实时检测 样品用量少(1ug) 检测灵敏度高（C0.01ng/ml） 无损伤检测 快捷方便 需预先制备传感器芯片 * 有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的。 DNA实际上是（细胞）中的建筑规划，而RNA就是蓝图，蛋白是建筑的砖瓦。” * 第一类，目标是鉴定与某个感兴趣的大分子相互作用的所有可能分子。在这种情况下，为了在一个大的范围内进行筛选，暂时不考虑生理学方面的重要性。第二类，与所关注的分子有相互作用的大分子已经被鉴定出来，接下来的目标是详细描述其生理功能及其相互作用对其功能的影响，即确立生理学上的意义。在这种情况下，在尽量接近胞内的条件下研究其相互作用非常关键。第三类，已经鉴定出存在的相互作用且在生理状态下得到了验证和合理的解释。在这种情况下，目标是设计一些高通量的方法能够鉴定出一些按照人们所期望的方式来调节这种相互作用的关键因子。没有一个技术适用于所有的这些领域；然而组合这些技术，就可能取得大的进展。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： 这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 * * The bait is going to be constructed with protein X so we take DNA coding for X and build it into a Yeast plasmid expression system along with DNA coding for the DNA binding domain of our transcription activator. We then use this construct to transfect yeast. By proper selection we end up with a beaker full of yeast, all expressing our hybrid protein of X atta