病毒包装及使用的常见问题病毒包装及使用的常见问题.docx

?病毒包装及使用的常见问题?1、问：关于病毒载体种类的选择的问题。从载体的毒性对实验的影响来说，是逆转录还是腺病毒好呢，还是其他病毒好？从操作的难度可行性来说是慢病毒要比腺病毒容易很多吗？答：操作难度上慢病毒与腺病毒都差不多,是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，AAV的制备就更复杂更难一些。从载体毒性而言，慢病毒毒性较大，但它相对较少引起受体的免疫原性，而腺病毒则有较大的免疫原性。腺相关病毒载体是比较理想的基因治疗载体，免疫原性较低，而且对受体伤害较少。从插入目的基因角度考虑，慢病毒最大插入基因长度是5k，腺病毒最大插入基因长度是8k，腺相关病毒最大插入长度是3k。对大多数研究者来说病毒仅仅是一个基因转移工具，在自己的研究工作中只代表工作量，并没有值得大写特写的地方。因此，把这样的工作委托出去，就象把测序、合成引物等工作交给别人做一样。即便是委托出去，也要明白自己的实验目的和要求是什么，才能很好地选择，同时尽量节省经费。以腺病毒载体为例，可以这样选择：买穿梭质粒，自己做构建、鉴定和大提，交给公司做出毒、扩增和纯化和检测。根据自己的实验要求，可以选择精纯化，也可以选择粗纯化；条件好的可以选择自己做一部分检测。至于你的实验是选择腺病毒好，还是慢病毒或别的病毒载体好，主要还看你的实验目的，其次才是看哪那种病毒载体容易做。?2、问：重组病毒产品如何运输和保存？答：病毒产品一般采取干冰运输。腺病毒及腺相关病毒也可以采用冰袋运输。避免重组病毒反复冻融，请酌情分装后于-80℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。在我们提供的保存液中，病毒产品-80℃保存期为半年。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4℃可保存1~2周。但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。?3、问：用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？答：是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的病毒外壳和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。?4、问：病毒载体可以浓缩或稀释吗？方法如何？答：可以浓缩。对于一般实验室用户，可以采用高速离心办法浓缩。目前市面上的病毒浓缩纯化办法很多，有不少商业化产品。不同的病毒纯化办法不同。腺病毒载体可以用300K以下的浓缩离心管（PALL?公司产品）进行浓缩。一般来说浓缩后的滴度以不超过3×1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完。?5、问：小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？体内表达时间和表达高峰如何？答：大部分文献显示，腺病毒用量范围在108-10IU/只小鼠。根据我们的经验，小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。?6、问：腺病毒载体对小鼠的半致死剂量（LD50）大概是多少？答：据我们的经验，静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50未测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡?7、问：VP，PFU，IFU?的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？答：VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。?8、问：感染细胞最佳MOI的测定？答：MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及