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PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型陆韵玲（广东 广州 510303）摘要：本实验随机抽取菜市场上的8头猪的猪肉，通过PCR-RFLP技术进行氟烷基因检测。结果表明，被检测到猪的基因型均为NN，未出现Nn和nn基因型，即市场上的猪肉是不含氟烷基因的。PCR-RFLP技术可准确诊断猪氟烷基因，在种猪选育过程中及时淘汰携带氟烷基因的个体，提高猪种质量。关键词：PCR-RFLP；基因分型；SNP；氟烷基因随着人民生活水平的不断提高，猪肉品质问题日益受到关注。SNP（Single Nucleotide Polymorpgism），单核苷酸多态性，指DNA发生了单个碱基的变异。这种变异可能会引起性状的改变或者导致疾病的发生。如猪的兰尼定受体（Rynodine receptor, RYR1）基因CDS序列第1843位碱基“C”突变为“T”，使蛋白第615位精氨酸（Arg,CGC）变成了半胱氨酸（Cys, TGC），引起蛋白结构和功能改变，这种改变能够引起猪的应激敏感综合征。猪在应激情况下，如长途运输、屠宰等，会对应激原刺激过度敏感，猪呼吸急促，心跳亢进，肌肉僵直，机体内水、电解质代谢紊乱，甚至突然死亡。对于商品猪而言，会导致猪肉质量严重下降，如肌肉苍白、质地疏松和有液体渗出等，大大降低了猪肉的经济价值。而氟烷基因是导致猪的应激敏感综合征的主效基因之一[1]。其杂合子（HalNn）虽然在生产性能上有一定优势，但其隐性纯合子（Halnn）是导致发生猪应激综合征。本试验采用PCR-RFLP技术对随机取自市场的8头猪进行氟烷基因检测，旨在研究氟烷基因对猪的影响，以及检测市场上猪肉的品质。1 实验材料与方法1.1实验材料8头猪的猪肉样本（来自广东第二师范学院附近的市场）。1.2实验试剂（1）PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。（2）凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，100×TAE或者100×TBE缓冲液等，DNA分子量标准，上样缓冲液（6×Loading buffer），溴化乙锭（EB）或者替代物。（3）酶切相关试剂：HhalI限制性内切酶，酶切缓冲液，等。1.3实验方法1.3.1猪基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测取200mg猪肉组织样本，剪碎，置于1.5mL离心管中，加入裂解液650μL,蛋白酶K25μL，混合均匀，50℃恒温孵育14~20h，直到看不到组织块，加入Tris饱和酚400μL，氯仿384μL，异戊醇16μL，室温震荡10~15min，12000r离心10min。取上清液于1.5mL离心管，加入700μL异丙醇（与上清液体积相当），轻轻晃动，直至白色絮状DNA出现，12000r离心10min。弃上清，留沉淀，75%乙醇漂洗，再离心，弃上清，加100μLddH2O（灭菌双蒸水）。配制1%琼脂糖凝胶，待胶凝固后，取1μL DNA溶液与5μL上样缓冲液混匀后加入点样孔，将胶放在电泳槽内，200V电泳15~20min后将凝胶取出放在紫外灯下观察并拍照，亮橘色条带表明DNA提取成功。1.3.2猪HAL基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测猪HAL基因的结构分析：登录GenBank查阅获得猪HAL基因序列，分析并设计引物，目的片段包括含有CDS序列第1843位碱基。目前，两条特异引物已经广泛用于检测猪HAL基因，该对引物位于第16和18内含子上，PCR扩增范围包括了HAL基因的第17外显子，具体如下：上游引物：5’ TCCAGTTTCC CACAGGTCGT ACCA 3’下游引物：5’ ATTCACCGGA GTGGAGTCTC TGAG 3’已有文献报道扩增产物为659bp，根据登录的参考序列，扩增产物实际为660bp。引物由生物公司合成。PCR反应体系的配制：按照如下比例配制，反应体积为20 μL。各成分的初始浓度和用量如下表1：表1 PCR反应体系（20μL）成分最初溶度或者含量体积(μL)10×Buffer含Mg2+）10×2dNTPs1.6Taq DNA聚合酶0.2上游引物10 nM/mL0.4下游引物10 nM/mL0.4DNA模板50 ng/μL0.4ddH2O15总体积20在配制上述溶液时，一般将除了DNA模板外的所有成分混合，均匀分装到灭菌的用于PCR扩增的Ep管中（0.2 mL规格）。在分装好的Ep管中加入DNA模板，盖紧盖子，瞬时离心，使各成分混合均匀。PCR反应程序:设置如下PCR程序：首先95 ℃预变性5min，然后94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸40s进行35个循环，最后72 ℃延伸5min后冷却到4 ℃。PCR扩增片段的检测:配制2%琼脂糖凝胶，取3μL PCR反应产物与3μL上样缓冲液混匀将其点入梳孔中，同时在其