454微生物分析44微生物分析.doc

454高通量测序方法 取适量污泥发酵混合液在10000rpm条件下离心5min， 然后使用OMEGA 公司 E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA合格后，利用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) 对细菌的16S rRNA的V1-V3区域扩增。 PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系包括：4 mL 5× FastPfu Buffer, 2.0 mL 2.5 mM dNTPs, 0.4 mL 前引物, 0.4 mL 反向引物，10.0 ng DNA 模板以及0.4 mL FastPfu Polymerase (TransStart FastPfu DNA Polymerase,TransGen). 95℃反应2min，然后进入扩增循环，每一次扩增循环分别在95℃，55 ℃和72℃温度下保持30s，共进行循环25次，最后在72℃保持5min，最后在10℃条件下5min褪火结束反应。每个样品3个重复，将同一样品混合后用2%琼脂糖凝胶电泳，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱；将已构建好的PCR产物文库参照电泳初步定量结果，，借助Promega公司的QuantiFluor? -ST荧光定量系统，用PicoGreen? dsDNA 定量试剂盒(PicoGreen? dsDNA Quantitation Reagent) 进行检测；获得标准曲线并对PCR产物文库定量，然后按每个样品的测序量比例混合，并使用Roche 指定的 （Roche emPCRAmp-Lib_L Kit）制备EmPCR产物，在Roche Genome Sequencer FLX + 进行上机测序。最后对数据进行分析优化，丢弃长度短于200bp、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列，获得优化序列数据。使用Furthest neighbor /wiki/Cluster）聚类生成OTU(按相似度97%)并进行生物信息统计分析。 表1. 不同发酵系统中高通量测序数据有效性总结 Sample ID α = 0.03 α = 0.05 Reads OTUs ACEa Chao1 Shannon OTUs ACE Chao1 Shannon Control 7603 2909 17398 8869 7.12 2442 10596 6325 6.85 nZVI 8098 2602 13627 7094 6.74 2204 10290 5691 6.47 Chao：是用chao1算法估计样品中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数， Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一， Shannon：用来估算样品中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。 图1. 空白和nZVI反应器中微生物文氏图 (97%相似度) Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Chloroflexi 和 Actinobacteria, 分别占总数的的88.2% （空白反应器）和88.8% (nZVI反应器) 。这些门类的微生物在厌氧发酵过程中的有机物的降解以及短链脂肪酸的形成起着重大作用。如Firmicutes 门类的细菌是厌氧第1 阶段的主要菌群，能够在水解酸化过程中产生纤维素酶、蛋白酶和各种胞外水解酶，并通过新陈代谢来降解纤维素、蛋白、多糖和氨基酸等有机物，是纤维素等复杂大分子的主要降解菌；Bacteroidetes 门类的细菌是污泥中温消化的主要降解菌，能够降解多糖等有机物，同时还能够产生氢气、二氧化碳、纤维二糖、葡萄糖和乙酸；Proteobacteria 门类的细菌也是污泥水解和产酸的主要菌。图2（B）进一步在纲类水平揭示了微生物结构在两个反应器（空白和加入nZVI）的变化情况，反应器中的微生物总共分为45个纲。空白反应中的微生物主要有Beta-, Alpha-, Gamma-, Delata-proteobacteria, Sphingobacteriia和Clostridia组成，而加入nZVI的反应器中主要由Beta-, Alpha- Gamma-, Delata-proteobacteria, Bacteroidia, Sphingobacteriia,