凝胶电泳-PPT分析.pptVIP

使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 4.2 Gold view Gold view是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 且现在的结果表明，Gold view没有明显的毒副作用。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 二 凝胶电泳具体实验操作 包括拿到产物之后的处理到配胶、点样、跑胶、切胶到胶回收等操作步骤。 冷冻、离心。 拿到产物之后，应先置于4℃冰箱冷冻，因为产物温度高会影响跑胶的效率以及很可能造成产物的气溶胶污染，待温度降下来后，瞬时离心。 配胶。 琼脂糖凝胶。根据产物的分子量的大小需配置不同浓度的胶。见下图： 琼脂糖凝胶浓度% 可分辨的线性DNA大小范围/（kb） 0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3 凝胶板有30ml、50ml、100ml三种，以制备50ml的0.1%的胶为例，于电子称上称取琼脂糖0.5g，倒入250ml锥形瓶，用量筒量取50ml的1×TAE缓冲液倒入锥形瓶，混匀，用锡箔纸盖住瓶口，置于电磁炉里中高火加热两分钟。同时将干净的置胶板放好、梳子插好，并备好染色剂。 3.染色和倒胶。 染色剂用goldview，其分辨率较EB稍差，但安全性更高。使用时避免其接触皮肤和眼睛。根据经验30ml的胶加4.5μL、50ml加7.5μL、100ml加10μL。待锥形瓶中凝胶溶液冷却至60℃左右时（不烫手），将goldview加入其中，摇匀，然后将凝胶溶液倒入置胶板上。避免气泡。 待胶凝固后（约15~30min），垂直拔出梳子，将胶放入电泳槽中，点样孔靠近负极。电泳液液面应至少高出胶板表面1~2mm。 4.加样。 取一只PE手套，铺平。根据样本个数将loading buffer点于手套上，一般每10μL点8~10个，吸取6μL样本和loading buffer吹打3~4次混匀后按顺序加入点样孔（小孔）中，点样时要预留出点marker的孔，一般maker点在两边紧邻样本的点样孔中。 loading buffer的功能主要有两个。第一、指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二、里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。 5. 电泳： 点完样后，将胶摆正，盖上电泳槽盖，设好电压电流以及跑胶时间，按启动开始跑胶。一般电压用5V/cm。一般等loading buffer中的溴酚蓝跑到胶的2/3处，即可关闭电泳仪，将胶取出送至成像仪拍照分析。 6. 胶回收： 跑完胶后，如有需要，可做胶回收，首先是切胶，将胶放在紫外分析仪的平台上，打开开关，在紫外下可以看到清楚的目的条带，迅速用刀片将目的条带切下，关闭电源，将目的条带装入已标记好并称重过的1.5ml离心管中，再次称重。然后可用TIANGEN的胶回收试剂盒进行DNA的回收。 附1.常用电泳缓冲液配方： 缓?冲?液 工?作?溶?液 贮?存?液（1000ml） Tris-乙酸 ? （TAE） ? ? 1×∶ 0.04mol/L Tris-乙酸 ? 0.001mol/L EDTA 50×∶242g Tris Na2EDTA·2H2O 37.2g ? 57.1ml冰乙酸 定容至1L ? Tris-磷酸 ? （TPE） 1×∶ 0.09mol/L Tris-磷酸 ? 0.002mol/L EDTA 10×∶108g Tris ? 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） ? 40ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） Tris-硼酸 ? （TBE