蛋白质工程 作业答案.doc

第三章 蛋白质工程 习题 1、名词解释：蛋白质工程：是基于对蛋白质结构和功能关系的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论及实践，是基因工程基础上的延伸，是第二代基因工程。 蛋白质分子设计：是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，即在知道了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，通过理论的方法，提出蛋白质改造的设计方案。 嵌合抗体：用DNA重组技术将鼠源单抗的可变区(V区)基因与人免疫球蛋白(Ig)的恒定区(C区 )基因相连接,构建成嵌合基因,导入宿主细胞进行表达,制成嵌合抗体。目前国内外已制备了数十种嵌合抗体。 PDB:蛋白质结构数据库。 2、请列表总结基因工程和蛋白质工程的相同点、不同之处（从结果、实质、流程等方面）及其联系。 基因工程 蛋白质工程 相同点 操作环境——生物体外；操作对象——基因；操作水平——分子 结果 天然存在的蛋白 自然不存在的蛋白 实质 基因重组 基因修饰或基因合成 流程 中心法则 中心法则逆推 联系 蛋白质工程是在基因工程基础上的延伸，是第二代基因工程 3、蛋白质工程的基本目标、基本途径是什么？ 答：基本目标：对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。 基本途径：基因修饰或基因合成：借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术 4、目前有哪些蛋白质工程分子改造的常用方法？ 答：⒈基因定点突变技术（小改）：即通过在DNA水平上进行碱基的取代、插入或缺失，达到改变基因，从而改变编码的蛋白质的结构的技术，包括核苷酸引物诱变，盒式诱变，PCR诱变，随机诱变。⒉基因剪切和融合（中改）：原理：将编码某蛋白的部分基因移植到另种蛋白基因上，经克隆、表达，产生新的融合蛋白。可达到使蛋白易于表达、纯化、细胞定位等，或使蛋白性质改变。⒊基因全合成（大改）：合成DNA，然后表达出相应蛋白。可以全部由人工控制，便于设计和改造，还适用于同时实现多处突变。 5、蛋白质工程中增加蛋白质稳定性的基本途径有哪些？ 答：蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。 设计目标 解决办法 热稳定性 引入二硫桥 增加内氢键数目 改善内疏水堆积 增加表面盐桥 对氧化的稳定性 把Cys转换为Ala或Ser 把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu 把Trp转换为Phe或Tyr 对重金属的稳定性 把Cys转换为Ala或Ser 把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu 替代表面羧基 pH稳定性 替换表面荷电基团 His、Cys以及Tyr的置换 内离子对的置换 提高酶学性质 专一性的改变 增加逆转数(turnover number) 改变酸碱度 6、请简述PCR介导的定点突变技术原理及优缺点。 答：4种引物3次PCR。优点：操作简单，突变的成功率可达100%。缺点：①后续工作较复杂，PCR扩增通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录，翻译等方面的研究。②不论是用普通的TaqDNA聚合酶还是高保真的Pfu酶，PCR方法产生的DNA片段都要经过核苷酸序列测定，方可确证有无其他突变发生。 7、天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，其结构如下。将胰岛素B9残基上极性的Ser置换为带电荷Asp，同时把B27极性的Thr置换为带负电荷的Glu，由此可制成速效胰岛素。请阐述其原理。 答：已知二体形成过程中，两个分子的结合面上SerB9与β链α螺旋上的Glu B13侧链相靠近，两个分子间的Glu B13相靠近，并且侧链上带有相同电荷，它们本身就有互斥作用。如果将临近的Ser B9置换为Asp，可在二体间形成连续4个带负电的侧链，在六体中这种互斥的接触重复三次，应该有利于降低胰岛素分子的缔合作用。经过这样的改造，双突变Ser B9 Asp/Thr B27 Glu有效地使二体在毫摩尔浓度下解聚为单体，它进入血液的吸收率也比天然胰岛素提高了三倍。核磁共振谱研究表明它也保持了与天然蛋白相同的只要结构特征。 8、枯草杆菌蛋白酶BNP不含二硫键，用蛋白质工程引入二硫键时，会有怎样的效果？ 答：蛋白质结构更加稳定，热稳定性增强，二硫键的形成迫使同一或不同肽链的不同区域的氨基酸残基向一起靠拢聚合，由此肽链迅速折叠并形成稳定的空间拓扑结构，该区域的氨基酸残基数量是高度密集的；同时疏水氨基酸残基围绕的二硫键，可形成局部疏水中心，拒绝水分子进入肽的内部破坏氢键，利于形成稳定的