TheSolubleHeparin-BindingEGF-LikeGrowthFactorStimulatesEGFReceptorTraffickingtotheNucleus..docx

可溶性肝素结合性表皮生长因子促进表皮生长因子受体转运到细胞核Nataliia V. Korotkevych*, Andrii Ju. Labyntsev, Denis V. Kolybo, Serhiy V. Komisarenko分子免疫学系，乌克兰国家科学院生物化学，乌克兰基辅palladin研究所摘要大多数的表皮生长因子受体（表皮生长因子受体）的配体有能力诱导表皮生长因子受体易位到细胞核中，在细胞核中表皮生长因子受体作为一个重要的转录调控因子。可溶性肝素结合表皮生长因子（sHB-EGF）在许多类型的细胞是表皮生长因子受体（EGFR）的一种配体；然而，目前没有证据表明sHB-EGF有诱导EGFR核输入的能力。在此，我们证明了在这里，用sHB-EGF处理A431细胞导致EGFR核定位且是通过逆行途径发生这种定位。由共聚焦显微镜和免疫共沉淀分析表明，易位复合体包括配体和受体两种。染色质免疫沉淀实验表明在细胞核中细胞周期蛋白D1启动子区域与SHB-EG-EGFR复合物的关联，通过EGFR激酶抑制剂AG-1478的应用阻止止这种关联。根据所获得的数据表明，SHB-EGF同样对其它EGFR配体起作用，并能够诱导EGFR的核易位作为配体 - 受体复合物中酪氨酸磷酸化依赖性的一部分。引言肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）是EGF生长因子家族中的一员。它具有高亲和力的肝素和硫酸乙酰肝素[ 1 ]。HB-EGF的前体合成的I型跨膜蛋白（Pro HB EGF），它的分裂是通过胞外蛋白酶，导致sHB-EGF脱落。sHB-EGF介导旁分泌和促进生存、增殖和不同细胞类型迁移的表皮生长因子受体家族的受体ErbB1（EGFR）和ErbB4自分泌活化[ 2 ]。这些自分泌和旁分泌的sHB-EGF活动可以作为肿瘤促进因子。目前很清楚的知道可溶性HB-EGF和proHB-EGF作用方式是不相同的，HB-EGF一些生物活性是以可溶性形式被限制（如诱导EGFR自分泌活化的能力）。配体结合到表皮生长因子受体导致表皮生长因子受体的激活，内化和进一步的循环，或者导致配体-受体复合物的溶酶体降解[3]。一些表皮生长因子受体成员如ErbB1 [ 4 ]，ErbB2[ 5 ]和ErbB3 [ 6 ]已以完整的形式在细胞核中检测出。这些受体的核定位也在不同的正常[ 7，9 ]或恶性细胞[ 10 ]中发现。所有ErbB蛋白含有核定位信号（NLS），核受体通过核孔复合体[ 11 ]运输需要这种信号。在细胞核中，这些蛋白可能通过直接与转录调控因子[ 12 ]结合来调节特定靶基因的转录。例如，核表皮生长因子受体作为一种转录因子，导致激活的基因需要高的增殖活动。当表皮生长因子被刺激后，EGFR转位到细胞核内与cyclin D1启动子近端结合后刺激其表达，引起细胞增殖[10]。有趣的是，EGFR本身缺乏DNA结合域，这就是为什么它会与其他的DNA因子如STAT3 STAT5结合需要EGFR的能力去激活特定基因[13,14]。据研究报道表明HB-EGF前体被局限在人膀胱移行细胞癌的肿瘤细胞核中[ 15 ]。核proHB-EGF可在活性氧（ROS）[16]的作用下从细胞核输出。然而，目前暂时没有证据表明sHB-EGF的核定位，以及sHB-EGF诱导表皮生长因子受体核易位能力。在本研究中我们解决了这些问题并揭示了sHB -EGF/EGFR复杂的核周区转运。材料和方法细胞培养A431细胞[ 17 ]是从乌克兰国家科学院放射实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所得到的，在RPMI-1640 L-谷氨酰胺培养基上进行细胞培养，添加10%的胎牛血清（FBS）和青霉素链霉素两性霉素B（σ-奥德里奇，密苏里，美国）。显微镜实验时，把细胞放在35毫米的盘子里盖上盖玻片接种过夜。质粒结构人的sHB-EGF和之前所描述的mCherry sHB-EGF重组质粒的构建。简单来说，这两种结构是基于pET28a质粒和大肠杆菌表达菌株BL21 DE3 Rosetta。编码来自U937细胞的HB-EGF的全长形式的DNA用于编码sHB-EGF的可溶性的扩增片段。扩增基因片段与用BamHI和XhoI酶切位点的表达载体pET28a合并。因此，基因工程的pET28a-SHB-EGF已获得。为了获得的pET-28amCherry-SHB-EGF，mCherry编码序列从质粒pmCherry（CLONETECH，USA）中扩增，在sHB-EGF的5’-端使用XhoI和PstI酶切位点酶切位点插入pET28a sHB-EGF，所有分子克隆试剂购自Thermo Scientific（MA，USA）购得。pEGFR EYFP质粒由V. Verkhusha（艾伯特爱因斯坦学院，美国纽约）教授亲情提供，P23 EYFP质粒由J. R?dow