《免疫学实验技术》实验讲义修订版2014..doc

亲们： 曾老师发来的实验讲义，下载打印，每次课带相应的讲义。 1.下周一实验1点开始，切记时间不要迟到哟。 2.作业：第一次（今天）的实验报告，还有“大吞噬”和小吞噬的图。 3.漂亮美女们要把头发扎好，为自己的健康着想哟。 吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察， 2.掌握小鼠腹腔注射给药和摘眼球放血及脊椎脱臼处死的方法。 试剂的准备： 1. MTT：称取50mg的MTT，溶于10ml PBS后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃避光保存。 2. ConA：25mg/瓶，Sigma出品。取25mg，溶于25mLPBS中，终浓度为1mg/mL，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃保存。用时取1mL，以无菌PBS稀释为100ug/mL（即稀释10倍）。 3. PBS：取市售配好的PBS粉末一袋，加1000mL蒸馏水，混匀，高压或过滤除菌，4℃保存。 4. 0.01N HCl-10%SDS：设市售浓HCl为10N（实际约为11N），取0.1mL加99.9mL蒸馏水稀释为0.01N HCl 100mL；称取10g SDS，置于100mL量筒内，以上述HCl溶解，使终体积为100mL，即得0.01N HCl-10%SDS。 5. 完全1640:取市售RPMI1640 89mL，加1mL 100×双抗、10mLFBS，即得含10%FBS的完全1640. 6. Tris-NH4Cl（红细胞裂解液称取3.735g氯化铵、Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4保存。μl，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，调整细胞浓度为5×106/ml。 细胞计数的方法： ①稀释脾细胞：在96孔血凝板内分别加白细胞计数液90μL/孔，根据细胞数量加2-3个孔；取脾细胞悬液10μL，依次10倍稀释。 ②取最后1孔的细胞悬液10μL置于白细胞记数板槽内，待细胞不再移动，100倍镜下进行细胞计数。 ③根据细胞计数结果，取适量细胞以完全1640稀释为5×106/mL 2、淋巴细胞增殖反应： 将5×106/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，100ul/孔，加6个孔，再加培养液100μL/孔；前3个孔加ConA 10μL/孔(终浓度5μg/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％ CO2，37℃培养72h。 3. 在培养结束前4-6小时，先将各孔中培养液小心吸出100μL/孔，注意加样器枪头勿碰触细胞；于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10μl/孔。37℃培养。 4. 4-6小时后，各孔内加入0.01NHCl-10%SDS 100μl, 振荡摇匀，37℃过夜。 5. 用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。抄录数据。 （四）实验结果 取实验组和对照组三个复孔的平均OD值。 转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。 注意事项 （1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。 （2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。 （3）为保持细胞活性，所有步骤（除破坏红细胞时）均需在低温或冰浴中进行。 实验三-1 凝集实验 原理：是颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应(agglutination)。细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，两者特异性结合且进一步聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。 分类：直接凝集试验、间接凝集试验、间接凝集抑制试验等 血球凝集试验：属直接凝集试验 材料：1％SRBC、1：20溶血素、生理盐水（NS）、24孔凹孔板、0.2mL加样器及枪头、37℃恒温箱 方法与步骤：对倍稀释法（第12孔为阴性对照，37℃，2h，4 ℃静置过夜 1 2 3 4 5。。。。。。。。。。。。11 12 生理盐水（ml） 0.2 0.2 0.2 溶血素（ml） 0.2 0.2 0.2 弃去 1：40 1：80 1：160 1%SRBC（ml） 0.2 0.2 0.2 结果判定：＋＋＋＋ 全部凝集，血细胞明显凝集，甚至成片卷曲，上清清亮 ＋＋＋ 两者之间，血细胞凝集成片，上清发红，