[PCR技术原理及其应用.ppt

PCR技术原理及其应用 §1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用 二、PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 以DNA为模板的反应 反应体积：50~100μl 缓冲液 引物 底物：4种dNTP 模板：102~105拷贝 TaqDNA聚合酶 矿物油 以mRNA为模板的反应（逆转录PCR） 逆转录反应体系 体积：20 μl 缓冲液 底物：4种dNTP 引物：oligo(dT)12~18 模板：RNA 逆转录酶 其他试剂：RNA酶抑制剂， MgCl2.DTT.牛血清白蛋白 PCR反应体系同以DNA模板的反应体系 10~50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72℃ 时pH 7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50 mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。 （三）PCR产物的积累规律 PCR产物的积累规律示意图 五、PCR引物的设计 （一）一般原则 ①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。 ②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。 ③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以免形成二聚体。 ④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。 ⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 直接提交模板序列到特定网页。 如：/cgi-bin/SGD/web-primer; / 引物设计软件。功能：首先是引物分析评价功能，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。 七、PCR中应注意的事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及Ep管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照：阳性模板 阴性对照：阴性模板 试剂对照：除模板外的所有组分 八、PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 一、PCR技术的主要类型 ㈠反向PCR 　 ㈥锚定PCR ㈡不对称PCR ㈦原位PCR ㈢RT-PCR 　　　　　　㈧重组PCR ㈣差异显示PCR　　　　㈨免疫PCR ㈤实时定量PCR　　　　㈩多重PCR 3）RT-PCR 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5＇和3＇末端序列，以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 5）实时荧光定量PCR real-time PCR，美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普通PCR相比，实时