几种胶体金技术详解..docVIP

胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析免疫渗滤分析免疫层析分析ELISA不同处是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在和ICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例 Frens标准方法： （1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL. （2）约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， （3）继续煮沸约5分钟后结束反应。 （4）冷却后用0.1MK2CO3溶液调至所需PH值。 （5）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。研究者已经注意到影响胶体金质量及其稳定性的几种因素，制备过程中器具若全部使用干净的玻璃器皿，溶液一律用0.2μm滤膜过滤后使用，水用玻璃三蒸水，推荐使用超纯水，采取这些措施后制得的胶体金很稳定。这些措施表明即使量污物都会对胶体金制备带来不良影响。虽然经常可见推荐使用硅化玻璃器皿的说法，其实使用普通玻璃器皿同样也能制出高质量高稳定性的胶体金。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。 那么从这个可以看出，在通过同一位置时，金溶液通过的速度是快速膜慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。综合以上，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性高所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。135s的一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法胶体金免疫渗滤分析（）原理与操作步骤基本与ELISA相同：加样品于固定有配体（抗体或抗原）的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体-抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体。当结果为阳性时，在膜上固定有抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。 样本要求： 样本采集后应尽快分离血清或血浆以避免溶血。检测时应尽量使用新鲜的样本。样本若不能及时送检，可在2°-8°冷藏3天。长期保存需冷冻于-20°C，忌反复冻融。发臭、溶血、脂血、细菌污染等异常样本请勿使用。 注意事项： 以GICA为例，它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析分析条，许多条件及条件的组合都会影响到它的质量，包括：（1）硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孔径的适宜性，结合配体（抗原或抗体）容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速度的均一性等；（2）捕捉配体的量及质量（配体的纯度，亲和力及滴度）