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实验：细菌基因组DNA的提取 制作人： 蔡甘露（113516229） 于 妍（113516230） 杨开莉（113516220） 杜 辉（113516222） 主讲人： 杜 辉 目录 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器、试剂 四、实验方法和步骤 五、实验注意事项 六、DNA提取常见问题 七、问题与讨论 一、实验目的 学会细菌基因组DNA的提取方法 观察提取出来的DNA物质 二、实验原理 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。在碱性条件下，用表面活性剂SDS将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的DNA。 三、仪器、试剂 1、仪器 离心管、离心机、试管、吸量管 2、试剂 （1）活材料：大肠杆菌（E.coli）或枯草杆菌（Bacillus subtilis） （2）培养基：LB液体培养基 （3）溶菌酶：100μg/ml （4）裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L乙酸钠，1mol/LEDTA，1%SDS （5）1%SDS（十二烷基硫酸钠）：1gSDS溶于100ml 蒸馏水，灭菌后-4℃保存 （6）mol/LNaCl：称取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸馏水，灭 菌后-4℃保存。 （7）无水乙醇及70%乙醇 （8）超纯水 （9）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA-Na2（pH：8.0） （10）饱和酚 （11）氯仿：异戊醇（25：1） 四、实验方法和步骤 1、DNA提取的一般方法 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 四、实验方法和步骤 2、DNA提取的实验步骤 菌体培养 37 ℃、16—18h 菌体收集 12000r/min、30s NaCl 充分混匀 12000r/min，10min 弃上清液 200μL裂解缓冲液 转移上清置新离心管 加Tris饱和苯酚 混匀 12000rmin，3min 取水层加氯仿 混匀12000r/min、3min 取上层清液加无水乙醇 12000r/min、3min 弃上清 沉淀加400μL 70%乙醇 洗两次 真空干燥 溶解DNA -20 ℃冰箱 五、实验注意事项 1、材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 2、采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。 3、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。 4、沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等。 5、晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。 1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3、DNA中残留有金属离子 1、重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 2、重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 3、增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） 六、DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 原 因 对 策 1、材料不新鲜或反复冻融 2、未很好抑制内源核酸酶的活性 3、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 4、外源核酸酶污染 5、反复冻融 问题二：DNA降解 对 策 原因 1、尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 2、液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 3、在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 4、细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5、所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 6、将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 1、简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。 酚氯仿抽提DNA后，会使溶液分层，上层为水相，含有 DNA；中间为蛋白（有时看不到）；下层为有机相。原因是酚 氯仿可以使蛋白质变性，从而从溶液中析出，但是蛋白密度 会小于酚氯仿，所以离心后它分布在中间；而DNA溶于水而不 溶于有机相。 2、沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇？ 是因为DNA不溶于乙醇，而乙醇可以夺取水，从而使得DNA 聚集沉淀，如果用乙醇沉淀的话一定要用2倍以上的无水乙醇。 也可以用异丙醇沉淀。 七、问题与讨论