凝胶过滤层析的分类课件.pptVIP

凝胶过滤层析（分子筛层析、排阻层析） 层析技术的分类： 按层析原理的分类： 1.吸附层析 固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而进行分离。 2.分配层析 固定相为液体，利用各组分在两种不相溶的溶剂间有不同的分配系数来实现分离的方法。 分配系数K=（固定相中溶质的浓度）/（流动相中溶质的浓度） 3.离子交换层析 固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 4.凝胶层析 固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离. 5.亲和层析 根据生物特异性吸附进行分离，固定相只和一种待分离组分有特异性的亲和能力而结合，而与无结合能力的其他组分分离。被分离的大分子与固定相发生可逆的非共价结合（如：抗原与抗体、激素与受体、酶的活性中心与专一的底物等。） 凝胶层析的原理：利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 凝胶层析柱的总体积Vt实际上是三种体积的总和，即V0（外水体积）、Vg（凝胶颗粒基质）、Vi（内水体积）的总和。其中Vi和Vg之和也即是层析柱固定的总体积。 1.总床体积： Vt =Vo+Vi+Vg 2.某一成分从层析柱内完全被洗脱出来所需洗脱液的体积 ： Ve=Vo+KdVi 分配系数： Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0：说明该物质完全分布于流动相，固定相分布为零。(分子很大，不进入凝胶网孔） Kd=1：表示该种物质能均等地分布在流动相，在两相间分配的比值为1。（分子极小，可自由通过网孔进出凝胶） 0Kd1：分子大小处于这两个极端之间，它的洗脱体积应在V0到V0+Vi之间；另一方面，相对分子质量与洗脱体积有关，所以在有适当的已知相对分子量的物质作为标准进行比较的条件下，就可以根据洗脱液的体积来估计物质的相对分子量。 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： （1）Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200 商品凝胶的型号，用吸水量的10倍数字表示（比如：每克干凝胶吸水量为2.5克时，其型号为G-25） （2）Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A （3）Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 （4）Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 凝胶及柱的选择 样品上柱 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 （蛋白质在280nm处的光吸 收值与其浓度成正比） 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 浓缩 c. 蛋白质分子量的测定 1. 柱要保持垂直。 2. 液面要高于胶面。 3．?要根据所需纯化物质的分子量选择胶的孔径。本实验用G-50。 4． 胶要充分膨胀，并去掉小颗粒。 5．?装柱要均一，胶面要平整，柱不能留有气泡（包括死空间），必要时可用玻棒在凝胶表面轻轻搅拌，再让凝胶自然沉淀。胶柱不能有断层。否则得重装。 6．? 装完后上样前要用洗脱液平衡。 7．?要稳压，控制洗脱液排出口与洗脱瓶之间的高度差，并控制洗脱速度，速度为6—7滴/分钟。 8．? 使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再上柱使用。 9. 上样时，缓慢沿层析柱内壁加于柱床表面。 * * 凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、蓝色葡聚糖检查、装柱、平衡 装柱时要注意操作压。 操作压=柱内液面和出水接管末端的高度差 装柱的注意事项：