[2013细胞培养实验讲义.docVIP

《细 胞 培 养》 实 验 讲 义 实验一 细胞培养室无菌环境的建立和实验器具的清洗、包装和灭菌 一、原 理： 防止污染是决定细胞培养成功的首要条件。由于体外细胞缺乏抗感染能力，因此无菌技术在细胞培养中显得尤为重要。 二、目的要求： 通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立细胞培养的无菌意识；掌握细胞培养室的消毒及灭菌方法；掌握培养用品的高温消毒方法。通过细胞培养室和主要设备的无菌环境建立，逐步掌握无菌操作概念。 掌握细胞培养室、培养箱和超净台的消毒方法；掌握玻璃器皿、金属器械、橡胶制品 的清洗、包装和灭菌方法。 三、实验材料： 细胞培养室环境、培养箱、超净台、边台、紫外线灯、70％酒精等等； 玻璃培养瓶、玻璃滴管、手术器械、圆筒、铝制饭盒等 电动高压锅、烘干箱、超声洗涤机、酸液及酸缸、纯水仪等 四、操作方法： 1、环境消毒 细胞培养室环境消毒用紫外线灯照射30～60分钟以上才能进入其内工作。培养箱箱体内壁和隔板可用70％酒精擦拭。超净台操作野主要用紫外线消毒。 2、器械清洗 （1）玻璃器皿的清洗：浸泡?刷洗?浸酸?冲洗（详见课件） （2）塑料器皿冲洗 反复利用塑料器皿需经清水浸泡后流水冲洗；流水冲洗?晾干?2％氢氧化钠浸泡过夜?清水冲洗?2～5％盐酸 浸泡30min?清水冲洗?蒸馏水漂洗3遍?晾干后包装，以备灭菌。 （3）胶塞等橡胶类用品的处理 新胶塞（含有大量滑石粉）：用清水冲洗? 2％NaOH煮沸15min?清水冲洗?2～5％盐酸煮沸15min?清水冲洗5次以上?蒸馏水漂洗5遍以上?蒸馏水煮沸10min ?倒掉废水，余热烘干胶塞备用（或经101.3 kPa高压灭菌）； 旧胶塞：用清水浸泡? 2％ NaOH煮沸10～20min ?清水冲洗?1％盐酸 煮沸30min?清水和蒸馏水漂洗5遍以上?蒸馏水煮沸10min ?倒掉 废水，余热烘干胶塞备用 （也可经101.3 kPa高压灭菌）。 （4）金属器械的清洗 新购金属器械：汽油纱布擦去油脂，清水冲洗?酒精棉擦拭，晾干； 用过的金属器械：清水煮沸消毒?擦拭干净?包装好高压灭菌消毒。 3、器械包装 瓶类——硫酸纸+牛皮纸+绳子扎紧 小器皿、胶塞、刀剪等——饭盒 吸管、滴管接口部用脱脂棉塞上，装入消毒筒内 无菌衣、帽、口罩均以牛皮纸或包布包好，绳子扎好 消毒灭菌 （1）干烤——玻璃器皿160～170℃90～120min，或180 ℃45～60min，金属器械、橡胶制品、塑料制品不能用干烤 （2）高压蒸汽灭菌——培养用液、橡胶制品、塑料器皿—— 67.55kPa（115 ℃ ）×10min；玻璃器皿、金属器械等可用101.33 kPa（121.3 ℃ ）×15～20min （3）滤过除菌——不耐热培养液和试剂 （4）紫外线——消毒物品表面 结果分析和讨论： 思考题： 细胞培养室和超净工作台的消毒要求有哪些？； 2、分别叙述玻璃培养瓶、培养液、PBS的消毒灭菌方法。; 实验二 细胞计数及密度换算 一、目的要求： 通过L929或HGC-27细胞的细胞计数，掌握准确计数细胞，掌握细胞密度的换算方法。掌握细胞计数板的使用和计数方法；掌握细胞密度换算方法 二、实验材料： L929或HGC-27细胞，血球计数板，倒置显微镜，计数器等。 三、操作步骤： 1、样品：取单细胞悬液，稀释到一定比例； 2、检查记数板：在正式计数前，先用显微镜检查记数板的计数室，看其是否沾有杂质或干枯的菌体。若有污物，则需作以下几步清洗：（1） 擦洗。 用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。（2） 冲洗。 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分（注意：勿用火焰来烤干）最后用擦镜纸揩干净。（3） 镜检。 镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。 加样：先将盖波片安方在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室，连续2~3次，直至充满计数室平台为止。 3、计数：将加好样品的记数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：（1）找计数室。先在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。 （2）转高倍镜。转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。 （3）计数：计数时应巡一定的路径，对横跨刻度上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。计数细胞时，数四个大方格的细胞总数。 （4）计算： 细胞密度：细胞数 / 原液体积（ml） ＝（四个大方格内细胞数之和 / 4） × 104 若原液稀释一定倍数后，再进行细胞计数，则 原液中细胞密度：细胞数