western+blotting实验操作步骤讲诉.doc

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB） WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A第一部分：蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项： 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）； 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）； 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）； 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）； 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 方法的选择 自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取 ； 购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 。 Example 1： 实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下： 提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）； 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）； 裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。 蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。 样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。 分装并存于-80℃，避免反复冻融。 B 第二部分： 相关试剂的配制： 10%的SDS（戴口罩称取）： 称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。 1.5M Tris/HCL（pH8.8） Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，室温下保存。 0.5M Tris/HCL（pH6.8） Trisbase 6.06g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至6.8，最后定容至100ml，室温下保存。 30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 2g 加双蒸水150ml，37℃加热溶解后，定容至250ml，查证该溶液pH应不大于7.0丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 0.5mM Trisbase(pH6.8) 2.5ml 甘油 2.0ml 10％SDS 4.0ml 0.4%溴酚蓝（mw669.97） 1ml 二巯基乙醇（mw78.14） 0.5ml 注：配好后分装-20℃保存。 电泳缓冲液 10倍储存液 1倍应用液 Trisbase 30g 3g 甘氨酸 144g 14.4g SDS 10g 1g 加水至1000ml，PH值用HCl调8.3。已经配制了1000ml的储存液。电泳缓冲液用应老师的电泳槽应用液300ml。用10倍的储存液30ml加入水270ml。 转移缓冲液（临用临配，铁盒子里搅拌混匀并4℃预冷）： Tris base 甘氨酸 H2O（ml） 甲醇（ml） 终体积（ml） 0.606g 2.88g 160 40 200 2.424g 11.52g 640 160 800 2板胶转移缓冲液的用量约为200ml。 洗涤缓冲液（TBS） 10倍储存液 1倍应用液 Tris base 24.2g 2.42g NaCl 80g 8g 加水800ml，用HCL调整PH为7.6，再加水至1000ml，已经配制了1000ml的TBS液，临用时再加0.1%的Tween-20。一般做两板胶要用洗涤缓冲液500ml；用储存液50ml加入450ml水，后加0.5ml Tween-20。 封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）—10ml/膜 脱脂奶粉 2g 洗涤缓冲液 40ml 两板胶4张膜要用封闭缓冲液40ml。 具体实验步骤： 准备： 准备器材：10%过硫酸铵；冰盒；预热恒温加热器；拿出试剂（双丙和TEMED提前从冰箱拿出平衡，否则凝胶