实验5细菌的单染色和革兰氏染色探究.ppt

实验五 细菌的单染色和革兰氏染色 目 的 要 求 学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。 了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术 。 实 验 原 理 微生物学中常用的是单染色法和革兰氏染色法。 实 验 原 理 实 验 材 料 菌种：E.coli （大肠杆菌） 、B.subtilis（枯草芽孢杆菌） 或实验室所培养杂菌 试剂：石炭酸复红染色液、革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄/番红染色液） 其他：显微镜、载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等 1. 涂片-干燥- 固定 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒左右，后立即用流水冲洗 5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。 结果与思考题 1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2.涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？ 3.革兰氏染色的原理、依据是什么？ * * G+：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,使菌体呈蓝紫色。 G—：细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 单染色法：是用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红 等）使其着色。 当在中性、弱碱性、弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷。而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷， 因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 实 验 程 序 一、单染色法： 涂片→干燥固定→染色→水洗→干燥→镜检（高倍镜、油镜） 二、革兰氏染色： 涂片→干燥固定→结晶紫初染→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→水洗→沙黄复染→水洗→干燥→镜检 1. 洗净载玻片：先将载玻片洗净，擦干。 2. 涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水(生理盐水)，按无菌操作法取样品菌涂片，做成菌悬液。（讨论：取菌多少对结果的影响？） 3. 晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 4. 固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 （讨论：固定的目的？） 单染色法 5. 染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。 6. 水洗：用水洗去涂片上的染色液。 7. 干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （讨论：干燥的目的？） 8. 镜检：先低倍观察，再高倍观察，最后用油镜。 单染色法视频 革兰氏（Gram）染色法： 革兰氏（Gram）染色视频 1.涂片不可太厚，会造成假阳性。 2.固定时不能在火上烤的时间太长，否则菌体收缩变形。 3.染色后必须晾干后才能用油镜镜检 。 4.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 5. 菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 染色中注意事项： * G+：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,使菌体呈蓝紫色。 G—：细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 * *