pEASYT1载体..docx

pEASY?-T1 Cloning Kit目录号：CT101试剂盒组成pEASY- T1 Cloning Vector (10 ng/μl)Control Template (5ng/μl), Control Primers (10 μM),M13F (10 μM)，M13R (10 μM)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell.保存Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent cell 可于–70℃保存至少六个月, 其他组分-20℃保存至少六个月。产品说明pEASY- T1 Cloning Kits适用于TA克隆.-快速克隆基因，仅需要5分钟反应时间。- 提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。- 对照插入片段克隆效率可达95% 以上。- 包含LacZ 基因，在含有IPTG，X-gal 的平板培养基上，可进行蓝白斑筛选。工作原理pEASY- T1 Cloning Kits 以线性的形式提供:-3′端悬垂胸腺嘧啶(T)可用于TA克隆 -拓扑异构酶与载体相互偶联（活化载体）Taq DNA聚合酶具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可在新合成双链产物的3’端加上一个碱基。尽管4种碱基均可被聚合到3’端，但Taq酶对dATP的聚合能力远高于其他3种dNTP.所以，在标准PCR条件下，PCR产物3’端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A。pEASY- T1 Cloning Kits在3’ 端提供一个悬垂的T碱基，这样的结构使PCR片段可以高效的和载体进行连接。牛痘拓扑异构酶I型可以与DNA双链的特定位置结合并切割特异位点5’-(C/T)CCTT-3’, 与3‘T的磷酸基团性成共价键，并切断其中一条DNA链，使DNA解链。磷酸二酯键断裂释放的能量储存于3’磷酸与拓扑异构酶氨基酸残基（Tyr-274）形成的共价键中。PCR产物5‘端羟基可以攻击形成的共价键使其断裂，释放拓扑异构酶，介导片段与载体的连接。操作方法?扩增目的条带?配置连接体系（加入载体和片段）? 室温孵育5分钟? 转化感受态细胞? 选择白色或是淡蓝色的克隆进行鉴定注意！引物5’端不能磷酸化。扩增使用Taq系列DNA聚合酶。.扩增反应后设置5-10分钟后延伸步骤，以保证产物的完整及聚合酶加A效率。扩增产物必须经过琼脂糖胶电泳检测。反应体系配置试剂 使用量新鲜PCR产物 0.5–4 μLpEasy-T1 Cloning vector 1 μL补足水至5μL轻轻混合，室温 (20℃-37℃) 反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。转化感受态细胞。注意！如不进行后期转化试验，连接体系可以储存于-20℃。推荐使用1μL载体最佳载体与片段摩尔比为1：7（在载体为1μL的情况下，可以粗略的按照“1 Kb长度的片段需加入20 ng的比例计算。如1 Kb加入片段20 ng、1.5 Kb加30 ng等）推荐使用3-5μL的反应体系。最佳反应时间① 片段大小为0.1-1 Kb（含1 Kb）：5-10 min② 片段大小为 1-2 Kb（含2 Kb）： 10-15 min③ 片段大小为 2-3 Kb（含3 Kb）： 15-20 min片段为胶回收产物，反应时间取最大值。延长连接时间可以使克隆数目有所增长，但反应时间不能多于30 min。最佳反应温度：25℃，若片段是高GC结构，可以37℃反应。（推荐用PCR 仪控温）转化Trans1-T1 Competent Cells加连接产物于50 μl Trans1-T1感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴20-30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加250 μl 平衡至室温的SOC/LB，200 转，37℃孵育1小时。取8 μl，500 mM IPTG，40 μl，20 mg/ml X-gal混合，待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 μl 菌液铺板，培养过夜（为得到较多克隆，4000 rpm 离心1 min，弃掉部分上清，保留100-150 μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。阳性重组子的鉴定和测序PCR方法分析阳性重组子挑选白色克隆至10 μl 无菌水中，涡旋混合。25 μl 反应体系中取1 μl 混合液用作PCR 反应的模板，用M13 正向引物和反向引物鉴定重组子。PCR 反应条件：94℃预变性10 分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性30 秒，55℃退火30 秒，72℃延伸（ 根据片段的大小确定延伸时间）30个循环，72℃后延伸10 分钟。确认包含重组子的克隆，扩大培养，用M13 F，M13 R 引物测序。若载体自连，通