探讨大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用.docVIP

探讨大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用摘要：　目的探讨大豆苷元对神经母细胞瘤ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡和增殖的影响。方法采用细胞生长抑制实验（ＭＴＴ法）、流式细胞仪检测等方法观察ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的形态变化、细胞凋亡率及细胞周期变化。结果１０．０ ～８０．０ μｇ／ｍｌ 的大豆苷元明显抑制细胞的增殖，且有剂量依赖性；与对照组相比，大豆苷元处理２４ ｈ 后，各组ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞均出现亚二倍体峰（Ｓｕｂ－Ｇ１ ），细胞凋亡率与大豆苷元呈剂量依赖性。结论大豆苷元可诱导神经母细胞瘤ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡，对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞增殖有明显的抑制作用。 关键词： 神经母细胞瘤 大豆苷元 增殖 　　神经母细胞瘤（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ， ＮＢ）是儿童较常见的恶性肿瘤，发病率占儿童恶性肿瘤的第３ 位，与儿童期常见的其他恶性肿瘤相比，化疗效果差，严重威胁儿童的生命安全。因此，寻找新的治疗药物成为人们十分关切的问题。近年来，多种研究发现大豆异黄酮对多种癌症具有抑制和治疗作用［１］ ，但对大豆异黄酮抗癌作用的研究主要集中在乳腺癌和前列腺癌等激素依赖性肿瘤，关于其对儿童神经母细胞瘤生长作用的影响研究报道很少。因此，我们于体外观察了大豆苷元对ＮＢ 细胞株ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 生长的影响，以期为进一步研究其作用机制及临床应用提供实验室依据。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞株为贵阳医学院分子生物学重点实验室赠送。大豆苷元（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）为陕西赛德高科生物股份有限公司馈赠，纯度为９８％。ＲＰＭＩ －１６４０ 为Ｇｉｂｃｏ 公司生产，小牛血清为杭州四季青公司生产，二甲基哑砜（ＤＭＳＯ）和噻唑蓝（ＭＴＴ）为Ｓｉｇｍａ 公司生产。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ 流式细胞仪为美国ＢＤ 公司生产；ＭＫ３ 型酶标仪和３１１１ 型ＣＯ２ 培养箱均为美国Ｔｈｅｒｍｏ 公司生产。 　　１．２ 方法 　　１．２．１ 细胞培养与接种ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞株培养在含５％小牛血清的ＲＰＭＩ －１６４０ 培养基中，ＣＯ２ 培养箱内（５％），恒温３７℃。当细胞长满时，用０．２５％胰蛋白酶消化，收集细胞，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心５ ｍｉｎ，ＰＢＳ 洗２ 次，以１ ～２ ×１０４ 的浓度接种于９６ 孔板内，每孔体积为１８０ ｍｌ。 　　１．２．２ 受试药物的处理将大豆苷元溶解在ＤＭＳＯ 中，配成１００ｍｇ／ｍｌ 的储存液， －２０℃保存。使用时用完全培养基将其稀释成１０ ｍｇ／ｍｌ 的工作液，用直径为０．２２ μｍ 的微孔滤膜过滤除菌置于４℃保存，并进一步用完全培养基分别稀释成所需的不同浓度，待细胞接种２４ ｈ 后分别加入不同浓度的受试药，每孔２０ μｌ，使其终浓度分别为０．１，１．０ ，１０．０，２０．０，４０．０ ，６０．０ ，８０．０，１００．０，１５０．０ ｍｇ／ｍｌ。每个浓度为４ 个孔，同时用含ＤＭＳＯ 的完全培养基和空白一起作对照。ＭＴＴ 用ＰＢＳ（ｐＨ ８．２）配成５．０ｍｇ／ｍｌ 的溶液，磁力搅拌器搅拌３０ ｍｉｎ，直径为０．２２ μｍ 的微孔滤膜过滤除菌后４℃保存，２ 周内有效。 １．２．３ 细胞生长抑制效应的测定采用ＭＴＴ 比色法［２］ 。细胞接种２４ ｈ 后加受试药，之后每隔２４ ｈ 用ＭＴＴ 比色法测定光密度值，即对应的活细胞数。具体操作如下：加受试药后每隔一定时间加ＭＴＴ 溶液１０ μｌ，３７℃继续培养４ ｈ，终止培养后小心吸去孔内培养上清液，每孔加入１５０ μｌ ＤＭＳＯ，振荡器振荡５ ～１０ ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。选择４９０ ｎｍ 波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，记录大豆苷元作用于ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的浓度效应数据和时间效应数据，用下列公式计算药物对细胞生长的抑制率，并绘制效应曲线。 　　抑制率（％）＝对照孔测定的平均OD 值－加药组测定的平均OD 值照孔测定的平均OD 值×１００% 　　表1 大豆苷元对SH-SY5Y细胞增殖抑制率的影响（略） 　　与对照组比较，★P＜0.05；n=3 　　１．２．４ 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分析各组细胞培养４８ ｈ 后，收集各组细胞悬液１ ｍｌ，浓度约为１０６ 个／ｍｌ，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，弃掉培养液，用ＰＢＳ 离心冲洗两次，以７０％的冷乙醇固定，４℃保存１ ～２４ ｈ，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ 后，ＰＢＳ 洗涤冲洗去乙醇２ 次；加入ＲＮａｓｅ Ａ（终浓度为６０ μｇ／ｍｌ），摇匀，３７℃温育３０ ｍｉｎ；加入ＰＩ（终浓度为５０μｇ／ｍｌ）染料１ ｍｌ，４℃暗染３０ｍｉｎ。流式细胞仪检测，每份标本测定（４ ～８） ×１０３ 个细胞，采用ＭｏｕｆｉｔＬＴ 软件对各组样本进行ＤＮＡ 含量及细胞周期分析。 　　１．３