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免疫PCR技术进展行政论文范文大全 免疫-PCR技术进展 　　摘要:免疫-pcr技术结合了抗原抗体反应的特异性和pcr的高敏感性，是一种极为敏感的抗原检测技术，并适合于各种微量抗原的检测。 　　荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度。但在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏度。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1ng/ml，但在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。1992年，sano 等人将免疫测定技术与pcr结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-pcr（immuno-pcr）。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。 　　众所周知，pcr技自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。而免疫-pcr技术正是运用pcr的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。 　　1 免疫-pcr的基本原理 　　免疫-pcr主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（elisa）的抗原抗体反应。第二部分即常规的pcr扩增和电泳检测。免疫-pcr与elisa的区别就在于elisa是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫-pcr则是以一段特定的双链或单链dna来标记抗体，用pcr扩增抗体所连接的dna，并进行电泳检测，因此可由pcr产物的量来反映抗原分子的量。由于pcr的高扩增能力，只要存在着极微量的抗原抗体反应，pcr都能大量扩增抗体所连接的dna分子，再用电泳来表明实验结果。免疫-pcr的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的dna连接到抗体上，在抗原和dna之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。最初sano等人建立的免疫-pcr实验流程如下：（1）再包被缓冲液稀释抗原bssa，并固定在微滴定板上。（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体，并洗去未结合的抗体分子。（3）加入稀释的已与生物素化puc19的结合的链亲和素-蛋白a嵌合体（蛋白a能与抗体结合，而链亲和素可与生物素化puc19中的生物素结合），并洗去未结合的嵌合蛋白-puc19复合物。（4）pcr扩增抗体所连接的puc19。（5）琼脂糖凝胶电泳，eb显色检测puc19. 　　运用这种方法，sano等人可检测到600个bsa抗原分子。与用碱性磷酸酶作为标记物的elisa方法相比，免疫-pcr的敏感度比elisa高106。在这免疫-pcr系统中，链亲和素-蛋白a嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。它的两个独立结合位点蛋白a和链亲和素分别与igg的fc段和生物素化dna中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系，通过pcr扩增，将抗原抗体反应的特异性高度放大。因此，免疫-pcr结合了抗原抗体反应的特异性和pcr的高度敏感性，成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术。 　　2 免疫-pcr的改进 　　虽然sano等人构建的免疫-pcr具有极高的灵敏度，但sano所用的连接分子链亲和素-蛋白a嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。ruzicka 等人以生物素化的抗体取代sano免疫-pcr系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白a嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-pcr系统。ruzicka用此免疫-pcr系统检测小鼠抗载脂蛋白e抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的e抗体。此外，sano的免疫-pcr实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。zhou 等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-pcr实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液（modified antigen dilution buffer, madb）代替sano免疫-pcr中的tbs作为抗原稀释液，它主要把tbs中 胍的浓度调到2m，由此解决了抗原的溶解问题。zhou检测了人原癌基因etsi，检测浓度可达到9.6×10-15m，是常规elisa的105倍。与sano的免疫-pcr系统相比，ruizicka和zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得